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大家好
我叫David Bikard

我是巴黎巴斯德研究院

合成生物学研究组的负责人

在本课中
我将探讨的是CRISPR系统

也就是原核生物的
适应性免疫系统

以及如何运用它们

作为研究和抵抗病源细菌的工具

首先
CRISPR的全称是

成簇规律间隔短回文重复序列

这个复杂的缩写词
是由信息专家创造的

用以描述这种基因排列
中基因座的解构

它很好地描述了其形象

可以看到这些成簇的重复序列

被不同排序的间隔区给隔开

该系统的发现目的是
作为一种适应性的免疫系统

也就是说
它能学会识别外来遗传因子

尤其是病毒性序列

或细菌噬菌体

这种作用分两个主要阶段进行：

一个免疫合成阶段
也叫适应期

或获取新间隔序列阶段

然后是免疫性阶段

此时
CRISPR系统运用其记忆

来抵抗未来的感染

在免疫合成阶段

具体情况是这样的
比如

一个噬菌体可能将其DNA
注入一个细胞

CRISPR系统可以
捕捉到这个DNA的一部分

然后以一种新间隔序列的形式

在两端重复序列之间将其纳入

它随后可以在免疫性阶段
通过把CRISPR基因座转录进

指导RNA或CRISPR RNA

来使用该信息

这将引领Cas蛋白

去毁坏同源序列

你需要知道的是

CRISPR-Cas系统的种类
非常丰富

有许多不同的Cas蛋白
能完成不同的功能

关于酿脓链球菌中的
CRISPR II-A系统

我想更详细地谈一下

因为它是在所有生物技术应用中

使用得最多的一种

其中有很显然的原因

那是因为
一个名为Cas9的蛋白

就足够完成这个免疫性
或干预性的步骤

除了Cas9蛋白以外

还有其他三种Cas基因

Cas1、Cas2、Csn2

它们对于适应期

以及新间隔序列的捕捉十分重要

所以这里
我再一次提到了CRISPR基因座

以及重复序列和间隔序列

此外还有一个重要的元素

叫做tracrRNA
意思是反式激活的crRNA

这种tracrRNA是与CRISPR

阵列中的重复序列同源的

也就是说当表现出来时

它会在示踪物和重复序列之间

形成一个双链RNA

这个双链RNA

能被Cas9和
RNase III识别

后者将处理CRISPR的初级转录

以形成Cas9, crRNA和
tracrRNA
之间的核蛋白复合体

该复合体不断扫描细胞内的DNA

并寻找其靶点

其做法是
首先寻找一个小序列模体

名为PAM,
是前间区序列临近基序的缩写

在酿脓链球菌中的Cas9
这种情况下

这种PAM模体
是一个简单的GG二核苷酸

当它找到这个PAM时
它将解开DNA

试图令其与CRISPR RNA配对

并且如果能成功的话

这将引发Cas9中的构象改变

并将带来两个催化区
RuvC和HNH

与DNA接触
并引入双重序列断点

因此
对这项工作的描述

促进了许多生物技术应用的发展

特别是在2013年

这一年被人称作
“CRISPR狂热”年

世界上的许多研究组都发表了

描述如何运用CRISPR工具

来编辑许多不同生物体
基因组的论文

我很幸运地为细菌方面的工作
做出一些贡献

但与此同时
我们也看到关于人体细胞

和许多其他模式生物的文章

比如斑马鱼、昆虫
植物，等等

这种技术的工作方法是

首先改变指导RNA

CRISPR RNA的序列

然后瞄准我们想修改的

基因组中的位置

Cas9将引入一个断点

这时候
通过控制之后发生的情况

我们能做很多事

如果我们能提供一个模板分子

能通过同源重组而被用来
修复断点

我们就能用它来进行
任何所期待的修改

比如点突变
基因的植入或删除

如果我们无法提供
这样一个模板分子

如果细胞能进行另一种修复

也就是非同源末端连接
简称NHEJ

那么这也能被细胞用来修复断点

但这种NHEJ途径
会产生许多错误

它将频繁引发植入或删除

也被称为"indels"
（基因的插入与删除）

这将在靶基因中产生
框架移动

而这可以用来剔除该基因

还有第三种可能的途径：

如果细胞无法修复断点
它们就将死亡

我们可以看到
在真核系统中

同源重组和NHEJ

是引入突变的好方法

但在细菌中
Cas9通常只会杀死细胞

我们依然能用它作为选择工具
来引入细菌中的突变

如果杀死细菌

这将不能引入我们期待的突变

我们在大肠杆菌中
进行了这项工作

我们首先引入在细胞中
携带Cas9的质体

然后
我们电穿孔另一个质体

其中有个以我们想要修改的基因
为靶点的CRISPR

还有一个携带相关突变
的寡核苷酸

我们在细胞中进行这项工作

在HME63
携带噬菌体重组酶

这将促进重组
而后

CRISPR系统将杀死

所有未引入突变的细菌

这可能是引入突变的一个
有效方法

在你想要的任何位置

我们也可以用Cas9
不是引入突变

而是也许作为一种抗微生物剂

也就是说
你可以改编Cas9

以对抗生素耐药的基因

或偏差因数为靶点

你能杀死携带这些基因的
特定细菌

让剩下的微生物丛不受影响

要达到这个目的
我们需要一种非常有效的方法

来针对靶细菌群
释放CRISPR系统

为此
我们采用了细菌噬菌体

更确切地说
只是噬菌体的衣壳

我们在此处组装了一个
CRISPR系统

我们可以通过Cas9和指导RNA
来注入CRISPR系统

来瞄准染色体中的一个位置

能够杀死细胞的位置

这是在金黄色葡萄球菌中

这种策略的演示

我们将一滴这种CRISPR
噬菌粒制剂

放到一个细菌的菌苔上

我们可以看到

只有当细菌的染色体中携带
一个靶基因时

我们才能杀死细胞

我们还想知道

如果靶点不在染色体而在质体上
会发生什么

答案是

质体上的CRISPR分裂
将不能杀死细菌

而是只能消除质体

这可能非常有用

因为你能让一个细菌群
重新对抗生素敏感

如果质体携带
对抗生素耐药的基因

而这种情况十分频繁

我们在这个USA300
金黄色葡萄球菌细胞中

来展示这一过程

具体做法是消除

携带一个对四环素抗药的基因
的pUSA02质体

我还想讲一下CRISPR系统
的最后一种应用

也是一种非常有意义的应用

也就是用一种催化失活的
Cas9的变种

也称为"dead Cas9"
或"dCas9"

这个变种无法再切割DNA

但依然能有力地
约束其靶点

我们和其他人都证明了
你可以用它来

抑制基因表达

我们也在大肠杆菌上
进行了这个工作

我们用Cas9来瞄准
一个基因的启动子区

或基因内部

我们可以看到
如果靶点是启动子

我们能得到对荧光报告基因
的强力抑制

不管指导RNA的方向如何

它瞄准的是基因的模板链
还是编码链

如果以基因内部为靶点

则瞄准编码链
变得至关重要

以便获得基因的有效抑制

最后
我想给大家一些

关于CRISPR系统的重要结论

首先
CRISPR-Cas系统

是适应性原核生物免疫系统

这些CRISPR系统中
有一些含有Cas9

是一种RNA指导的核酸酶
很容易被改编

以切开靶序列

在细菌染色体重的Cas9切割

可导致细胞死亡

我们可以一种用名为“dCas9”

的催化失活的Cas9变种

来抑制基因表达

至此
我想感谢大家对本课的关注

我希望你有机会

在未来运用这些了不起的
CRISPR工具

非常感谢！