当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第四章 酶活力的测定 > 第三节 酶米氏常数的测定 > 菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)
我们已经学习过了菠萝蛋白酶活力的测定
相信同学们已经掌握了酶学
实验的设计原理和思路
以及酶活力测定和比活力的计算方法
同学们能够根据实验原理和实验指导
独立的完成菠萝蛋白酶米氏常数的测定
实验和结果计算吗
菠萝蛋白酶
米氏常数测定的实验操作
与酶活力的测定类似
不过在设计上
因为要让一定量的酶与不同
浓度的底物发生反应
所以需要用缓冲液和酪蛋白先配置
一系列不同浓度的底物溶液
注意底物浓度的设计
要使其倒数也是整数
便于绘制标准曲线的横坐标
配置好的一系列浓度底物
预先在水浴中温热到37度
同时把酶液也温浴到37度
把定量的酶液加入到不同浓度的底物中
注意每管之间间隔固定时间
然后开始计时
10分钟后依然每管之间间隔固定
时间加入终止试剂三氯乙酸
确保每管的反应时间都是准确的
10分钟
米氏常数的
测定实验中同样需要设计对照管
理论上来说
应该针对每一只不同底物浓度
的酶反应管设计对照管
并同步进行反应
扣除掉酶管中非酶促反应时间生成的产物
针对本实验
我们在前期预实验的时候发现
每只对照管中产物的生成量都非常少
所以就将对照管简化为一管
也就是最高底物浓度的管
最后统一扣除
每反应结束后离心去除蛋白质
然后将上清与酪氨酸标准曲线一起测定
计算每管中生成酪氨酸的浓度
在此基础上计算每管中酪氨酸生成的速度
也就是反应速度 V
以S/1和1/V为横纵坐标作图
计算米氏常数的KM和V max
我们在淀粉酶的米氏常数测定一节中
已经给大家分析过反应速度
和底物浓度的计算方法
主要是确定反应体系的体积
请同学们自己根据我们提供的数据
练习一下KM和V max的计算
在下一节中
我们一起来讨论计算结果
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试