当前课程知识点:基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第一节 蛋白质分离纯化的常见技术 > 凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择
同学们
这个视频我将要介绍
依据分子大小进行蛋白质
分离纯化的技术
凝胶过滤层析 什么是凝胶过滤层析?
是利用分子大小进行蛋白质
分离纯化的一种层析技术
习惯上也把它称为
凝胶层析或者排阻层析
有时也称之为分子筛层析
名字可不少
让我们看看这种层析技术
如图片所示
层析柱中的凝胶颗粒是内部具有
很多孔道的网状固体物质
当样品混合物加入层析柱后
小分子物质能够进入
层析颗粒内部的孔道中
而大分子的物质被排除在凝胶孔道外
无法进入凝胶颗粒
它们通过凝胶颗粒外的空隙
随洗脱液向柱的下部移动
这里有两种分子
绿色代表小分子物质
蓝色代表大分子物质
你可以想象一下
如果某样品混合物加入层析柱中
可以进入层析凝胶颗粒的小分子物质
与无法进入凝胶颗粒的大分子物质
哪一种先被洗脱下来呢?
从图中可以看出
如果将
混合物样品加入层析柱中洗脱时
比凝胶颗粒网孔大的蛋白质
不能进入凝胶颗粒内部
比凝胶颗粒网孔小的蛋白质
则容易进入凝胶颗粒内部
进入凝胶颗粒内部的小分子物质
在层析柱中行走路径长
通过
层析柱的时间长
在洗脱时最后流出层析柱
这里将演示凝胶过滤层析的简单过程
这是层析柱
里面装有凝胶颗粒
这是加样后的层析柱柱顶部
放大可以看到有凝胶介质
蓝色小球不能进入凝胶颗粒内部
表示大分子量蛋白
红色小球可以进入凝胶颗粒内部
表示小分子量蛋白
开始洗脱 蓝色大分子量蛋白走得快
先行流出柱子
红色小分子量蛋白走得慢 后流出柱子
通过部分收集 就能够达到分开两者的目的
常见的凝胶过滤层析凝胶种类有4种
如表所示有交联葡聚糖凝胶
商品名为Sephadex
聚丙烯酰胺凝胶
商品名为Bio-Gel P等
琼脂糖凝胶
商品名为Sepharose等
以及琼脂糖
和葡聚糖形成的复合凝胶
商品名为Superdex
当然还有一些其他种类
不同种类的凝胶都具有
各自不同的多种型号
它们的属性也不同
在实际工作中可以根据需要进行选择
例如在进行蛋白质分离纯化时
可以选择Sephadex系列
或者Bio-Gel P系列
两者在工作pH范围
分离物质的相对分子量范围比较相似
而Sepharose是大孔径的凝胶
分离大分子物质的相对分子量下限
是Sephadex系列
或者Bio-Gel P系列的上限
适合分离相对分子量为
40万以上的大分子
例如病毒和核酸
这里以交联葡聚糖(Sephadex)为例
简单介绍一下4种型号
凝胶过滤层析的凝胶种类
图片显示的是出售的Sephadex -100
表格显示的是4种
不同型号的葡聚糖凝胶
如G-25
G-75
G-100
和G-200
这里只写出了4种
其实还有很多种
例如G-10,G-50
和G-150等;
G表示不同规格型号的葡聚糖
字母 G后面的数字表示
干凝胶吸水量的10倍体积
从表格中可以看出
不同型号凝胶的物质
分离范围有所不同
分离蛋白质时
根据要分离蛋白质的相对分子量进行
柱层析填料型号的选择
假如现在实验室有SephadexG-25
G-75
和G-150三种凝胶
学生准备分离大豆中的脲酶
脲酶的相对分子量是48.3万
他该选择哪种凝胶呢
从表格数据可知
SephadexG-25
分离范围是相对分子量处于
1000~5000范围
用途是除盐
SephadexG-75分离范围是相对分子量
处于3000~8万
用途是分离中等分子量大小的蛋白质
而Sephadex G-150
分离范围是相对分子量处于
5000~30万
用途是分离较大分子量的蛋白质
依据表格中的信息
我们首先排除Sephadex G-25
因为它的主要用途是除盐
即将小分子和大分子物质分开
不适合用来分离相对分子量较大的
蛋白质混合组分
如何在G75和G150之间选择
从理论上讲
G75和G150
最大排阻相对分子量分别
是8万和30万
而脲酶相对分子量是48.3万
原则上选择两种脲酶本身
都无法进入凝胶颗粒
而直接从凝胶颗粒间隙被洗脱出来
也就是说选择任何一种都可以
但是考虑到脲酶来自大豆
大豆匀浆液经过粗分级分离后
仍然含有多种蛋白质
如果这些组分中很多相对
分子量都大于8万的话
就很难将它们与脲酶分开
如果选择G150
则混合物中相对分子量
小于30万的蛋白质
都可以进入凝胶颗粒的孔道
如此选择就更加容易获得含有
其它蛋白组分更少的脲酶
假如我有两种层析柱
一种是G75
一种是G150
如图所示G75的排阻
相对分子量是8万
而G150是30万
我准备上柱的蛋白混合物样品有4种
它们相对分子量分别是A组分28万
B组分24万
C组分6万脲酶48.3万
如果样品上样到G75层析柱中
洗脱结果是C组分进入凝胶颗粒内孔道
脲酶A和B组分都不能
进入凝胶颗粒内部
三者可能会一起被洗脱下来
结果可能造成获得的
脲酶含有多种其他组分
如果样品上样到G150层析柱中
则只有脲酶不能进入凝胶颗粒内部
其它组分都进入凝胶颗粒内部
如此就能比较容易的获得
纯度较高的尿酶
以上是本视频的主要内容
下面我小结本视频
在这个视频中我首先讲解了
凝胶过滤层析的原理
之后简单介绍了
常用凝胶的种类及特性
并以Sephadex为例
说明了4种葡聚糖凝胶的分离范围
及用途
最后举例说明
依据分离的蛋白质相对分子量大小
进行凝胶的选择
下面的视频我将介绍凝胶层析柱的
操作流程和注意事项
等待你的参与!
-第一节 基础生物化学实验学什么?
-第二节 本课程评分标准
--本课程评分标准
-第三节 如何更好的完成本课程的学习?
-第四节 生化实验室安全注意事项
-第五节 本课程教学团队介绍
--本课程团队介绍
-第六节 课前须知作业
-第一章 课前须知 作业
-第一节 移液器的设计原理和使用规范
-第二节 移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的操作要点
--移液器的日常校准
--移液器的日常校准
-第二章 移液器的使用 作业
--第二章 移液器的使用 作业
-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范
-第四节 分光光度计的操作要点
-第五节 分光光度法测定待测物浓度
--分光光度法的原理
--分光光度法的原理
-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范
-第二章 分光光度计的使用 作业
--第二章 分光光度计的使用 作业
-第七节 离心机的设计原理和使用规范
--离心机的操作要点
--离心机的操作要点
-第二章 离心机的使用 作业
--第二章 离心机的使用 作业
-第一节 蛋白质的定量测定
-第三节 其他物质的测定
-第三章 物质的定量测定 作业
--第三章 物质的定量测定 作业
-第一节 酶活力测定的常用方法
-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定
-第三节 酶米氏常数的测定
-第四章 酶活力的测定 作业
--第四章 酶活力的测定 作业
-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术
--蛋白质的盐析提纯
--蛋白质的盐析提纯
--盐析操作注意事项
--盐析操作注意事项
--离子交换层析
--离子交换层析
--亲和层析
--亲和层析
--IMAC亲和层析
--IMAC亲和层析
--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业
-第二节 核酸的提取和检测
--第五章 第二节 核酸的提取 作业
-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳
--核酸琼脂糖电泳-作业
-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳
--SDS-PAGE的原理和操作-作业
-《基础生物化学实验》期末考试