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凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择在线视频

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凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择课程教案、知识点、字幕

同学们

这个视频我将要介绍

依据分子大小进行蛋白质

分离纯化的技术

凝胶过滤层析 什么是凝胶过滤层析?

是利用分子大小进行蛋白质

分离纯化的一种层析技术

习惯上也把它称为

凝胶层析或者排阻层析

有时也称之为分子筛层析

名字可不少

让我们看看这种层析技术

如图片所示

层析柱中的凝胶颗粒是内部具有

很多孔道的网状固体物质

当样品混合物加入层析柱后

小分子物质能够进入

层析颗粒内部的孔道中

而大分子的物质被排除在凝胶孔道外

无法进入凝胶颗粒

它们通过凝胶颗粒外的空隙

随洗脱液向柱的下部移动

这里有两种分子

绿色代表小分子物质

蓝色代表大分子物质

你可以想象一下

如果某样品混合物加入层析柱中

可以进入层析凝胶颗粒的小分子物质

与无法进入凝胶颗粒的大分子物质

哪一种先被洗脱下来呢?

从图中可以看出

如果将

混合物样品加入层析柱中洗脱时

比凝胶颗粒网孔大的蛋白质

不能进入凝胶颗粒内部

比凝胶颗粒网孔小的蛋白质

则容易进入凝胶颗粒内部

进入凝胶颗粒内部的小分子物质

在层析柱中行走路径长

通过

层析柱的时间长

在洗脱时最后流出层析柱

这里将演示凝胶过滤层析的简单过程

这是层析柱

里面装有凝胶颗粒

这是加样后的层析柱柱顶部

放大可以看到有凝胶介质

蓝色小球不能进入凝胶颗粒内部

表示大分子量蛋白

红色小球可以进入凝胶颗粒内部

表示小分子量蛋白

开始洗脱 蓝色大分子量蛋白走得快

先行流出柱子

红色小分子量蛋白走得慢 后流出柱子

通过部分收集 就能够达到分开两者的目的

常见的凝胶过滤层析凝胶种类有4种

如表所示有交联葡聚糖凝胶

商品名为Sephadex

聚丙烯酰胺凝胶

商品名为Bio-Gel P等

琼脂糖凝胶

商品名为Sepharose等

以及琼脂糖

和葡聚糖形成的复合凝胶

商品名为Superdex

当然还有一些其他种类

不同种类的凝胶都具有

各自不同的多种型号

它们的属性也不同

在实际工作中可以根据需要进行选择

例如在进行蛋白质分离纯化时

可以选择Sephadex系列

或者Bio-Gel P系列

两者在工作pH范围

分离物质的相对分子量范围比较相似

而Sepharose是大孔径的凝胶

分离大分子物质的相对分子量下限

是Sephadex系列

或者Bio-Gel P系列的上限

适合分离相对分子量为

40万以上的大分子

例如病毒和核酸

这里以交联葡聚糖(Sephadex)为例

简单介绍一下4种型号

凝胶过滤层析的凝胶种类

图片显示的是出售的Sephadex -100

表格显示的是4种

不同型号的葡聚糖凝胶

如G-25

G-75

G-100

和G-200

这里只写出了4种

其实还有很多种

例如G-10,G-50

和G-150等;

G表示不同规格型号的葡聚糖

字母 G后面的数字表示

干凝胶吸水量的10倍体积

从表格中可以看出

不同型号凝胶的物质

分离范围有所不同

分离蛋白质时

根据要分离蛋白质的相对分子量进行

柱层析填料型号的选择

假如现在实验室有SephadexG-25

G-75

和G-150三种凝胶

学生准备分离大豆中的脲酶

脲酶的相对分子量是48.3万

他该选择哪种凝胶呢

从表格数据可知

SephadexG-25

分离范围是相对分子量处于

1000~5000范围

用途是除盐 

SephadexG-75分离范围是相对分子量

处于3000~8万

用途是分离中等分子量大小的蛋白质

而Sephadex G-150

分离范围是相对分子量处于

5000~30万

用途是分离较大分子量的蛋白质

依据表格中的信息

我们首先排除Sephadex G-25

因为它的主要用途是除盐

即将小分子和大分子物质分开

不适合用来分离相对分子量较大的

蛋白质混合组分

如何在G75和G150之间选择

从理论上讲

G75和G150

最大排阻相对分子量分别

是8万和30万

而脲酶相对分子量是48.3万

原则上选择两种脲酶本身

都无法进入凝胶颗粒

而直接从凝胶颗粒间隙被洗脱出来

也就是说选择任何一种都可以

但是考虑到脲酶来自大豆

大豆匀浆液经过粗分级分离后

仍然含有多种蛋白质

如果这些组分中很多相对

分子量都大于8万的话

就很难将它们与脲酶分开

如果选择G150

则混合物中相对分子量

小于30万的蛋白质

都可以进入凝胶颗粒的孔道

如此选择就更加容易获得含有

其它蛋白组分更少的脲酶

假如我有两种层析柱

一种是G75

一种是G150

如图所示G75的排阻

相对分子量是8万

而G150是30万

我准备上柱的蛋白混合物样品有4种

它们相对分子量分别是A组分28万

B组分24万

C组分6万脲酶48.3万

如果样品上样到G75层析柱中

洗脱结果是C组分进入凝胶颗粒内孔道

脲酶A和B组分都不能

进入凝胶颗粒内部

三者可能会一起被洗脱下来

结果可能造成获得的

脲酶含有多种其他组分

如果样品上样到G150层析柱中

则只有脲酶不能进入凝胶颗粒内部

其它组分都进入凝胶颗粒内部

如此就能比较容易的获得

纯度较高的尿酶

以上是本视频的主要内容

下面我小结本视频

在这个视频中我首先讲解了

凝胶过滤层析的原理

之后简单介绍了

常用凝胶的种类及特性

并以Sephadex为例

说明了4种葡聚糖凝胶的分离范围

及用途

最后举例说明

依据分离的蛋白质相对分子量大小

进行凝胶的选择

下面的视频我将介绍凝胶层析柱的

操作流程和注意事项

等待你的参与!

基础生物化学实验课程列表:

第一章 课前须知

-第一节 基础生物化学实验学什么?

--《生物化学实验》学什么?

--《生物化学实验》学什么?

-第二节 本课程评分标准

--本课程评分标准

-第三节 如何更好的完成本课程的学习?

--不同需求的同学如何学习本课程?

--不同需求的同学如何学习本课程?

-第四节 生化实验室安全注意事项

--生化实验室安全注意事项

--生物化学实验室安全注意事项

-第五节 本课程教学团队介绍

--本课程团队介绍

--本课程教学团队介绍

-第六节 课前须知作业

--我对本课程的了解和疑惑

-第一章 课前须知 作业

第二章 生命科学三大必备仪器的使用

-第一节 移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

--移液器的设计原理和使用规范

-第二节 移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--移液器的操作要点

--正向移液和反向移液

--正向移液和反向移液

--移液器的日常校准

--移液器的日常校准

--移液器的操作中易错点

--移液器操作中的易错点

--Eppendorf移液器操作手册

-第二章 移液器的使用 作业

--第二章 移液器的使用 作业

--请用思维导图或表格的形式列举移液器的使用要点

-第三节 分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

--分光光度计的设计原理和使用规范

-第四节 分光光度计的操作要点

--不同分光光度计的设计和操作差异

--不同分光光度计的设计和操作差异

--分光光度计的操作要点

--分光光度计的操作要点

-第五节 分光光度法测定待测物浓度

--分光光度法的原理

--分光光度法的原理

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

--分光光度法测定物质浓度的实验设计

-第六节 荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的原理和使用规范

--荧光分光光度计的设计原理和使用规范

-第二章 分光光度计的使用 作业

--第二章 分光光度计的使用 作业

-第七节 离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的设计原理和使用规范

--离心机的操作要点

--离心机的操作要点

-第二章 离心机的使用 作业

--第二章 离心机的使用 作业

-如何养成规范使用仪器设备的好习惯

第三章 物质的定量测定

-第一节 蛋白质的定量测定

--学习蛋白质定量测定的意义

--学习蛋白质定量测定的意义

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质浓度的实验原理

--紫外法测定蛋白质的浓度的实验指导

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的操作方法

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--紫外法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--双缩脲法测定蛋白质的浓度的实验原理

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验指导

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--双缩脲法测定蛋白质浓度的实验数据计算

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质浓度的实验原理和操作方法

--Lowry法测定蛋白质的浓度的实验指导

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--Bradford法测定蛋白质浓度的实验指导

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质的浓度的实验原理和操作方法

--BCA法测定蛋白质浓度的实验指导

-第三节 其他物质的测定

--核黄素荧光光度定量测定法

--核黄素(VB2)荧光光度定量测定法

-第三章 物质的定量测定 作业

--第三章 物质的定量测定 作业

-你现在能独立设计一个生物分子的定量测定实验吗?

第四章 酶活力的测定

-第一节 酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

--酶活力测定的常用方法

-第二节 菠萝蛋白酶活力的测定

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力测定的原理和操作

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力的测定(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶比活力测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶活力的计算(Folin酚法)

-第三节 酶米氏常数的测定

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数的测定和计算

--淀粉酶米氏常数测定的实验指导

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的原理和操作(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数测定的实验指导(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

--菠萝蛋白酶米氏常数的计算(Folin酚法)

-第四章 酶活力的测定 作业

--第四章 酶活力的测定 作业

-查阅一个你感兴趣的酶,想想怎么测?

第五章 物质的分离纯化

-第一节 蛋白质分离纯化的常见技术

--基因工程生产人血清白蛋白之路

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--蛋白质分离的一般原则和基本步骤

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--蛋白质的盐析提纯

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--盐析操作注意事项

--盐析操作注意事项

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--蛋白质的有机溶剂和等电点沉淀

--离子交换层析

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--亲和层析

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--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--蛋白质的超速离心、透析和超滤

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--凝胶过滤层析的操作过程和注意事项

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--IMAC亲和层析技术的基本步骤

--第五章 第一节 蛋白质的分离纯化 作业

-第二节 核酸的提取和检测

--核酸的制备原理及基本步骤

--核酸的制备原理及基本步骤

--质粒DNA的提取制备

--质粒DNA的提取制备

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--拟南芥叶片基因组DNA提取

--紫外分光光度法测定核酸

--紫外分光光度法测定核酸

--第五章 第二节 核酸的提取 作业

-你想得到什么分子,如何纯化呢?

第六章 利用电泳对生物大分子进行检测

-第一节 核酸琼脂糖凝胶电泳

--核酸琼脂糖凝胶电泳的原理

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--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖凝胶电泳的染色及结果分析

--核酸琼脂糖电泳-作业

-第二节 聚丙烯酰胺凝胶电泳

--SDS-PAGE电泳的原理

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--SDS-PAGE电泳凝胶的染色

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--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--利用SDS-PAGE计算蛋白质的分子质量

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--聚丙烯酰胺凝胶的聚合原理及相关特性

--SDS-PAGE的原理和操作-作业

-除了电泳,还有什么用于生物大分子鉴定的方法?

第七章 期末考试

-《基础生物化学实验》期末考试

-请留下你对本课程的宝贵建议

凝胶过滤层析的原理及凝胶颗粒选择笔记与讨论

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