流式细胞仪的工作原理在线视频

同学们好

这个知识点是要跟大家讲的是

流式细胞仪的工作原理

流式细胞术它是上世纪70年代发展起来的

一种以快速准确客观

可以同时检测单个微粒

主要我们在医学上用的是细胞的多项特性

并加以定量的进去

并且对特定群加以分选

这个流式细胞术它的特点有几个 三个

一个是研究对象

它是细胞

我们主要是细胞和微生物

它是研究这些微粒和包括就是细胞

它的物理或者生物学的特征

并对这些特征加以定量

它的研究的内容

是细胞的一个群体特异性

不是一个单个单个的

它是细胞群体的一个特性

我们这个流式细胞术它是一个技术

要完成这个技术就要有一个仪器

流式细胞仪就是一种集

流体力学 细胞化学 激光技术

电子物理学 光电技术 电子计算机图像处理等

细胞荧光等等技术为一体的这种高新科技仪器

这个流式细胞仪它的原理

它是一定波长的这种激光束

是用激光直接照射到高压驱动的

液流内的细胞上

然后产生的光信号被多个接收器接受

一个是在激光束直线方向来接收到的

叫做前向散射光信号

另外一个还有其他的就是在激光束的垂直方向

垂直方向上接受的一些信号

它就包括测向角散射光和荧光信号

这个散射光和荧光信号它的强弱

它能够反映每个细胞的物理和化学特征

这是一个流式细胞仪的工作原理图

这个细胞从这里再经过这个流动

经过这个检测磁这个是激光照射过来

然后照着这个细胞上

它会产生前向散射光 侧向散射光

以及红色的荧光 绿色的荧光等等

还包括其他的一些荧光

这些信号我们通过接收器接收以后

通过计算机处理可以成为散点图

也可以成为一些直方图

流式细胞仪它的特点就是

单个细胞或者微粒的分析

对单个细胞和微粒的分析

同时可以检测多个参数

那它的检测速度每一秒钟可以检测一万个细胞

它提供的是一个统计学意义上的一些结果

提供细胞群体的均值和分布情况

还有可以分选出我们感兴趣的细胞或微粒

然后拿这些细胞或者微粒再进行进一步的研究

流式细胞仪它主要它的结构主要分为三个系统

一个液流系统 光路系统和检测分析系统

首先我们来看这个液流系统

这是一个液流系统的图

这个是鞘液流式细胞里最重要的一个试剂

它是鞘液

然后这个是样本

然后样本跟鞘液混合的时候

这里是一个放大的这个喷嘴

在这个喷嘴这里

样本是在被鞘液裹住在中间

然后通过这个喷嘴喷出去

激光跟这个喷嘴是垂直的一个检测

下面这个图它就是我们放大的

一个鞘液与液流聚焦的一个原理图

鞘液的最大作用就是把这个液流里面的

这个细胞呈单个单个的通过这个检测孔

除了液流系统第二个就是这个光路系统

光路系统是流式细胞仪的一个灵魂

它是由一系列的透镜 滤光片和小孔组成

透镜它有长通滤片还有短通滤片

还有这个带通滤片

这个什么叫做长 短 带

就是常通那就是长的波长能够通过的滤光片

短的波长能够通过的

或者带就是一段波长能够通过的这种滤光片

这个是一个滤光片它的原理图

这个是一个短通滤光片

长通滤光片和带通滤光片

这个短通是什么

标记了650

那就说650以下波长的光

它可以通过650以上的它就被阻止了

这个是常通那就是大于这标记的是550

大于550的波长的它可以通过

小于550的被阻止

带通这标记的是600到100

那就是说600正负50

那就550到650这个波长的光可以通过

那这个波长之外的光就被阻止了

这个是一个通透镜

这个是一个反光的叫做二项通透镜

它650的波长短通的话

650 小于650的可以通过

大于650的它不是阻止

它不是像这里被阻止

它而是被反射出去

后面这一个是同样的原理

在光路系统还有一个重要的就是激光

我们要通过激光照在细胞上

这个激光首先要经过透镜聚焦

聚焦成一个20微米64微米的这种一个椭圆形

它的能量的分布

也是在这个中间能量分布是最高的

边边能量是比较低的

这个是一个光路系统的示意图

我们可以看到激光照射到细胞上发出荧光

各种颜色的光

通过不同的滤镜把这些光分解开来

这个是双向的

然后分解到不同的检测器

这个是一个光路的示意图

这个是我们说用488的激光从侧面接收光信号

然后再分离的一个示意图

我们可以看到荧光发射以后

然后这是一个605的这个短通

小于605的就过来了

然后这边是一个550的长通

大于550的过来

大于550小于605的就能够穿过去

小于550的它就在这个光线过来了

然后再转折过来

最后我们得到的是515到550纳米的一个光

这个光大概是FITC这种荧光素

它发射的光我们就可以检测

前面两个讲的是液流系统 光路系统

后面流式细胞仪还有一个就是检测分析系统

它是以通道为单位

将细胞的光信号汇总分析

得出群体细胞的这个物理化学特性

根据光性质的不同

分为散射光这个通道和荧光通道

我们首先看散射光

散射光它又分为前向角散射光和侧向角散射光

它是不因为这个

任何细胞样品的这个制备技术而变化的

所以被称为是细胞的一个物理特性或固有的参数

它对这个光的光的波长

是与激光的波长是相同的

这是一个示意图

这前向角和侧向角的一个检测原理示意图

我们可以从这个图里面也可以看到

什么是前向角

这个是我们这个激光照射过来

这个是前向角的这个散射光

这个是侧向角的散射光信号

前向角散射光信号

它主要跟细胞的相对大小及其表面积相关

侧向角的你看这些光从这里出来的

它跟细胞的力度及细胞内的相对复杂性是相关的

所以它们给出的细胞的这种特性是不一样的

荧光信号

这个是荧光信号我们激光照射细胞以后

细胞我们标记了各种荧光的一些物质

在细胞内或者细胞膜上

然后它就会产生荧光

产生荧光我们这有荧光的接收器

可以接受这些荧光

我们每个通道

就不同的通道FL123

这是不同的通道名称

我们用不同的荧光素标记的话

每个通道它接受的荧光的波长是不同的

FITC前面我们讲过示意图是510到550

这个不同的荧光素它是不一样

但是我们的激发光都是488纳米

我们在检测一个光的信号的时候

我们有三个参数

一个是脉冲的面积

一个是高度

一个是宽度

因为这个面积比高度和宽度更加准确

所以我们一般都是用这个面积

因为高度它的差异性没有面积的差异性大

有些时候这个参数

这个是它的宽度

有些时候这个宽度也是有意义的

比如我们在区分这个联体细胞

双联体细胞和单个细胞的时候

我们就可以通过它的宽度

可以看到

这个时候你当看高度和面积就看不出来

今天我们讲课的主要内容就是

流式细胞仪它的工作原理

仪器主要分三个部分

液流系统 光路系统和检测分析系统

我们的课今天就讲到这里