当前课程知识点：基因工程 > 第五章 外源基因的表达 > 5.2 真核表达系统 > 5.2 真核表达系统
同学们大家好
今天我们来学习真核生物表达系统
真核生物基因表达系统有酵母表达系统
丝状真菌表达系统 昆虫表达系统
哺乳动物细胞表达系统和植物生物反应器等
大肠杆菌表达系统
是最常用的原核表达系统
那么酵母表达系统
就是最常用的真核表达系统
比如我们现在注射的乙肝疫苗
就是用酵母表达系统生产的
酵母菌是一群以芽殖
裂殖为繁殖方式的单细胞真核微生物
酵母的遗传物质由染色体DNA
线粒体DNA和质粒组成
酵母的基因组大小约为12兆
比原核生物大一些
但是比高等动植物又小的多
同样有很多株酵母菌进行过全基因组测序
遗传背景清楚
酵母作为表达系统还有哪些优点呢
第一 单细胞生物
操作与大肠杆菌一样简单 培养基廉价
第二 酵母具有真核细胞对翻译蛋白的加工
及修饰过程
可以生产真核来源的蛋白质
第三 酵母具有分泌功能
可使某些外源蛋白分泌到胞外 方便纯化
第四 我们的很多食品中都含有酵母
比如包子 面包等发酵面食
所以酵母是非常安全的基因工程受体系统
目前人们利用酵母
已经成功表达了许多外源蛋白
比如刚才提到的乙肝疫苗
生长因子 人血清蛋白等
常用的酵母表达系统有酿酒酵母表达系统
毕赤酵母表达系统等
酿酒酵母是最早构建的酵母载体
其中含有一个2微米的
6318bp的质粒
在宿主细胞核内的拷贝数维持在50到100个
酵母载体的构建主要包括复制子
选择标记和克隆位点
酵母的基因组上每隔30到40kb
就有一个单一自主复制序列ARS
载体可以选择ARS作为复制子
称为YRP
如果选择2微米质粒的复制子
就叫做YEP
这两种载体转化宿主后都可以自主复制
每个细胞可以达到200个拷贝
酿酒酵母表达系统
已经成功用于重组异源蛋白的生产
可以直接表达也可以让其分泌型表达
但是也暴露了一些问题
第一 由于酵母自身乙醇发酵途径的活跃
导致生物大分子的合成代谢受到抑制
因此外源基因的表达水平不高
第二 酿酒酵母的质粒在几代扩增后
容易丢失
第三 酿酒酵母能使异源重组蛋白超糖基化
使得异源蛋白与受体细胞
紧密结合而不能大量分泌
这些问题可以用毕赤酵母来弥补
毕赤酵母表达系统的蛋白修饰
更接近哺乳动物
能把各种异源蛋白分泌到培养基中
巴斯德毕赤酵母是一种甲基营养菌
培养基中的甲醇能诱导甲醇代谢途径中
各种酶的高效表达
甲醇代谢途径的第一步反应
乙醇氧化酶基因AOX的启动子
是目前发现的最强的真核启动子
受到甲醇的诱导调控
自从1987年巴斯德毕赤酵母
作为宿主表达外源蛋白以来
越来越引起人们的重视
与其它表达系统相比
毕赤酵母表达系统具有以下优势
生长迅速 外源蛋白表达水平高
产物可以翻译后修饰
糖基化程度比酿酒酵母弱
产物可以正确折叠和高效分泌
可以利用简单无机盐培养基
高密度发酵 生物量大
实验室和工业操作都很方便
杆状病毒表达系统
是目前应用最广的昆虫细胞表达系统
通常采用目宿银纹夜蛾杆状病毒
作为表达载体
昆虫细胞培养及操作较简便 成本低
因此被广泛用于生产基因工程产品
新构建的杆状病毒-S2表达系统
重组杆状病毒感染S2细胞后
不会引起宿主细胞的裂解
且蛋白表达水平与鳞翅目细胞相似
因此杆状病毒是一个
很有应用前景的昆虫细胞表达系统
由于其操作安全 表达量高
目前与酵母表达系统一样
被广泛应用于基因工程的各个领域中
由哺乳动物细胞翻译后再加工
修饰产生的外源蛋白质
在活性方面远胜于原核表达系统及酵母
昆虫细胞等真核表达系统
更接近于天然蛋白质
将外源基因导入哺乳动物细胞
主要通过两类方法
一是感染性病毒颗粒感染宿主细胞
二是通过脂质体法 显微注射法
磷酸钙共沉淀法等非病毒载体的方式
将基因导入到细胞中
目前病毒载体已成为动物体内
表达外源基因的有力工具
在临床基因治疗的探索中
也发挥了重要作用
另外逆转录病毒感染效率高
某些难转染的细胞系
也可通过其导入外源基因
但要注意的是逆转录病毒
可整合入宿主细胞染色体
具有潜在的危险性。
最后我们来总结一下
一个理想的可诱导表达系统
需要具备哪些特点
首先这个系统应该不受到内源因素的影响
而仅能被外源的非毒性物质所诱导
第二 这个系统不能对宿主本身的
细胞通路有干扰
第三 表达系统在不诱导时
应该仅有本底表达
活性最低
在诱导下应该迅速达到高水平表达
第四 如果需要应用到人体
诱导物或者其调节分子
能快速到达需要起作用的组织
第五 诱导剂能够快速被各组织清除
使得系统快速恢复到非活化水平
最后 诱导剂的浓度与表达量应该成正比
便于定性定量分析
总之 各种表达系统各有其优缺点
选择表达系统时
必须充分考虑各种因素
如所需表达的蛋白质性质
实验条件 生产成本
表达水平 安全性等
权衡利弊后再选择相应的表达系统
好了 我们的课程关于基因工程操作的部分
就讲完了
后面的内容我们要来学习一下
基因工程在生产生活中各方面的应用
大家再见
-1.1 绪论和基本概念-是什么让玫瑰开出了蓝色的花朵-带你初次了解基因工程
-1.1 绪论和基本概念--作业
-1.2 发展历史-基因工程是如何形成的
--1.2 发展历史
-1.2 发展历史--作业
-1.3 分子生物学基础
--1.3.1 分子生物学基础1-为什么人类可以繁殖后代-中心法则的发现
--1.3.2 分子生物学基础2-揭示孩子为什么长得像父母-基因表达
--1.3.3 分子生物学基础3-生物体内的蛋白质的如何形成的-基因表达的翻译和调控
-1.3 分子生物学基础--作业
-2.1 核酸提取-怎样得到生物体内的DNA-核酸提取告诉你真正原因
--2.1 核酸提取
-2.1 核酸提取--作业
-2.2 核酸检测-如何检测我们是否已经得到了DNA
--2.2 核酸检测
-2.2 核酸检测作业
-2.3 PCR原理-使DNA变多的好方法
-2.3 PCR原理--作业
-2.4 PCR影响因素-通过实验将DNA变多
-2.4 PCR影响因素--作业
-2.5反转录PCR及cDNA文库构建
-2.5反转录PCR及cDNA文库构建--作业
-2.6 全基因组扩增及基因组研究
-2.6 全基因组扩增及基因组研究--作业
-2.7 工具酶-基因工程中的剪刀和和胶水-工具酶
--2.7 工具酶
-2.7 工具酶--作业
-3.1 蓝白斑筛选-有趣的蓝白斑筛选-根据颜色筛选菌株扥方法
-3.1 蓝白斑筛选--作业
-3.2 质粒载体-谁来帮助科学家完成转基因技术
--3.2 质粒载体
-3.2 质粒载体--作业
-3.3 病毒载体-将变多的DNA放入质粒载体中，为后期测序做准备
--3.3 病毒载体
-3.3 病毒载体--作业
-4.1 受体细胞-生物体中无私奉献的细胞
--4.1 受体细胞
-4.1 受体细胞--作业
-4.2 转化-将选中的基因导入到细胞中的方式
--4.2 转化
-4.2 转化--作业
-4.3 重组子的筛选和鉴定-对特殊加工过的物质进行筛选和鉴定
-4.3 重组子的筛选和鉴定--作业
-4.4 DNA测序技术-检测质粒载体中是否有我们提取到的DNA
-4.4 DNA测序技术--作业
-5.1 原核表达系统
-5.1 原核表达系统--作业
-5.2 真核表达系统
-5.2 真核表达系统--作业
-6.1 基因工程的应用--工业
--6.1.1 改造后的大肠杆菌生产半胱氨酸-除了用毛发生产半胱氨酸，还可以用大肠杆菌生产半胱氨酸
--6.1.1 改造后的大肠杆菌生产半胱氨酸 --作业
--6.1.2 重组基因技术大量生产维生素C--作业
-6.2 基因工程的应用--农业
--6.2.1 含有维A的黄金大米-为什么我们能够生产出金色的大米？
--6.2.2 苏云金杆菌的bt毒蛋白-教你生产出一种具有抗虫害能力的植物
--6.2.3 转基因植物和除草剂抗性-这是一种能够阻止杂草生长的植物
--6.2.1含有维A的黄金大米--作业
--6.2.2苏云金杆菌和bt毒蛋白--作业
--6.2.3转基因植物和除草剂抗性-作业
-6.3 基因工程的应用--医学
--6.3.2 基因工程药物-赫赛汀-微生物可以为人类生产多种药物
--6.3.3 基因治疗-交界型大疱性表皮松解症-将一些基因放入大肠杆菌体内，能够表达出更多的蛋白质
--6.3.1基因工程重组疫苗-乙肝疫苗--作业
-- 6.3.2 基因工程药物-赫赛汀--作业
--6.3.3基因治疗-交界型大疱性表皮松解症--作业
-6.4 基因编辑-一种可以治疗疾病的技术
--6.4 基因编辑
-- 阅读下面的参考资料，讨论基因编辑技术在人类医学领域运用的问题。
-6.4 基因编辑--作业
-基因工程的争论和生物安全-基因工程是一柄双刃剑
-基因工程的争论和生物安全--作业
-实验一
--实验一
-实验一--作业
-实验二
--实验二
-实验二--作业
-实验三
--实验三
-实验三--作业
-实验四
--实验四
-期末考试
-实验四--作业
