当前课程知识点：分子生物学 > 第四章 DNA的复制 > 4.4 随机复制对半保留复制的补充 > 4.4 随机复制对半保留复制的补充
前面我给大家讲过了
DNA半保留复制的原理和详细的过程
在一个复制叉里
前导链合成方向与复制叉解链方向一致
连续合成
滞后链合成方向与复制叉解链方向相反
分段合成
两条链合成速度协同调控
以避免在同一个复制叉
内的两条新生链相差太大
在相当长一段时间里
这样的复制机理被科学界广为认同和接受
然而近年来
利用单分子实时荧光标记
和微流控反应体系
通过全内角反射荧光显微镜
实时观测和记录了单个复制叉
上的前导链和滞后链的合成情况
发现
虽然从整体上看
前导链和滞后链的平均合成速度相差不大
然而
在每一个单位时间内
两条链的合成速度完全是
独立的并表现出了相当大的随机性
并且伴随着散发的停顿
在合成停顿的时间内
DNA解旋酶可以
继续引导复制叉的解链
但是速度大大减慢
使得滞后的DNA合成可以跟随上来
该实验利用我们之前讲过的滚环复制分子
利用滚环复制的其中一个原因
就是在滚环复制中
前导链可以一直合成下去
因此可以不受模板链
长度的限制持续观测复制的过程
滚环复制前导链的5‘端用生物素标记
再通过生物素与固定在玻片上的
链霉亲和素的结合而将整个双链
环状DNA分子固定在
一个微流控反应体系的玻片凹槽上
随着反应体系的单向流动
滚环复制合成的前导链顺着流动方向展开
为保证大肠杆菌E.Coli的
基因组复制的体外复制
反应体系中需要至少
13个不同的蛋白质组分
解旋酶DnaB
两个分子的DNA聚合
酶核心酶（core polymerase αεθ）
分别复制前导链和滞后链
一个β滑钳
实际上是两个拷贝的DnaN分子
围绕复制模板链和新生子链
的3‘端形成环状二聚体
辅助DNA聚合酶在模板链上合成的进行
再加上滑钳装载复合物
这几组成分组装成一个大的复合物
来完成在两条模板链上的快速复制
在反应体系中加入DnaC810
DnaB DNAPolIII β
4种rNTP（RNA引物原材料）
和4种dNTP中的3种
组装成空转的起始前复合物
由于滞后链缺少引物
因此此时β滑钳仅装载在前导链上
然后洗去多余的组分
这时在系统中添加引物酶（Primase）
β 单链结合蛋白（SSB）和
所有4种dNTP和rNTP
启动前导链和滞后链的复制
同时在反应体系中加入SYTOX orange
该荧光染料仅能标记双链DNA
然后通过全内角反射
荧光显微镜实时观测复制的进程
由于这个微流控
反应体系的流动方向是单向的
而滚环复制的前导链5’端是固定的
因此随着前导链的不断
合成延伸以及液体反应体系的单向流动
环状双链部分就顺着流动方向移动
移动的轨迹可以通过
SYTOX orange的荧光检测到
通过实时监测的图片结果我们可以看到
这些点状荧光代表环状双链模板分子
直线的荧光信号
代表正在进行滚环复制的DNA
我们可以追踪观测每一个单分子
可以从图上看出
大约18%的被标记的分子在进行复制
通过这些结果
我们还可以计算出
DNA复制的片段长度和复制的速度
复制速度的分布符合正态分布
同时从这个结果中我们
可以注意到这些直线荧光信号是连续的
而SYTOX orange
只能标记双链DNA
那么我们可以推断出
前导链和滞后链的合成速度是协调的
另外
为了分析反应体系中的每一种
蛋白质在复制中扮演的角色
该实验逐个检测了缺失单个
蛋白的反应体系对DNA复制的影响
结果发现只有引物酶（primase）
是滞后链合成所独有的
其他的蛋白质成分均为前导链和
滞后链的合成所共同需要的
在缺少引物酶的情况下
前导链的合成速度也不受影响
因此
利用缺少了primase的反应体系
就可以单独观测前导链的复制情况
追踪单个滚环复制的分子
并连续拍照
结果令人惊讶地发现
DNA聚合酶随机暂停复制
暂停的次数可以是一次也可以是多次
也可以完全不暂停连续复制
在DNA聚合酶暂停复制的期间
解旋酶DnaB可以继续解旋
但解旋速度显著下降
等待DNA聚合酶重启复制
也就是说
DNA的合成和解链
经过一个短时间的脱节以后
重新调整步调
协调一致
实验还观测到
引物酶的浓度与滞后链冈崎片段
合成的长度成反比
同滞后链合成的速度成正比
在图中SYTOX orange标记双链DNA
因此在连续的线性荧光中段的部分
就反应的是不连续合成的
冈崎片段造成的模板链单链部分
通过调整反应体系中引物酶的浓度
可以控制滞后链的合成速度
结果发现改变反应体系中引物酶的浓度
从0nm到饱和浓度
前导链的合成速度均不受影响
说明前导链和滞后链的
DNA聚合酶完全自主
相互独立
为了直接观测冈崎片段的合成情况
该实验又利用
地高辛标记的UTP标记3‘端羟基
再用荧光标记的抗地高辛的抗体
直接观测冈崎片段的数量和长度
发现引物酶的浓度
与冈崎片段的数量成正比
与冈崎片段的长度成反比
因此
为了方便监测滞后链的合成速度
使用低浓度的引物酶以
保证有较长片段的冈崎片段合成
同样利用荧光标记的
抗地高辛的抗体检测到
滞后链的合成速度与
前导链的合成速度相匹配
这个研究揭示了DNA复制中
两条模板链相互完全独立
随机复制
但却又在整体合成速度
上得到协调一致的现象
作为经典的DNA半保
留复制机制的重要补充
这部分关于DNA的随机复制
是DNA复制机制研究的最新进展
利用了包括单分子荧光标记
和全内角反射荧光显微成相
等先进技术
并且在实验设计上
巧妙的利用了滚环复制
和微流控反应系统
可能同学们在理解上有一些难度
我们在课后进一步讨论
这节课我们先介绍到这里
谢谢大家
-1.1 a brief history of molecular biology
--分子生物学的历史
-2.1 生物大分子
-2.2 生物大分子复合物
-第二章单元测试
-3.1 核酸的结构
-3.2 核酸的理化性质
-3.3 染色体的结构
-3.4 基因，基因组及人类基因组的特点
-第三单元测试
-4.1 the discovery of genetic material
--4.1 遗传物质的发现the discovery of genetic material
-4.2 半保留复制的过程和特点
-4.3 几种特殊的复制形式
-4.4 随机复制对半保留复制的补充
-第四章单元测试
-5.1 转录的起始及RNA聚合酶
-5.2 启动子的特点及转录因子
-5.3 转录的延伸和终止
-5.4 转录后的加工
-第五章单元测试
-6.1 遗传密码子的破解和密码子的“简并性”
-6.2 tRNA的结构特点
-6.3 核糖体的结构特点
-6.4 蛋白质的翻译过程
-6.5 蛋白质的翻译后修饰
-6.6 mRNA在细胞内的非随机分布与翻译
-第六章单元测试
-7.1 氨基酸与蛋白质
-7.2 蛋白质的四级结构
--蛋白质的四级结构
-7.3 蛋白质的理化性质
--蛋白质的理化性质
-7.4 蛋白质的结构域，蛋白质家族及种系进化分析
-第七章单元测试
-8.1 操纵子模式及原核基因表达的调控
-8.2 真核基因表达转录和转录后水平的调控
-第八章单元测试
-9.1 突变概述
--9.1 突变概述
-9.2 突变的后果及修复
-9.3 人工突变，表型筛选及育种
--9.3 诱突育种
-第九章单元测试
-10.1 DNA指纹与个体识别
-10.2 基因编辑与伦理
-第十章单元测试
