3.2 核酸的理化性质在线视频

上一节课我们熟悉了核酸的结构

由于其结构就决定了核酸的理化特性

首先我们说DNA分子

DNA是线形大分子

由于其非常高的轴比

也就是说长宽比

人类DNA分子平均长度在4 cm以上

而双螺旋直径只有2 nm

长度直径比高达千万数量级

因此

DNA溶液粘度极高

DNA分子也极易在机械力作用下折断

如果是做过基因组DNA纯化的

同学可能会注意到

将提取的DNA最后

溶解于buffer或者水中时

吹打DNA溶液

或者轻弹管壁帮助溶解时

会感觉到DNA溶解像胶水一样

这个就是由于DNA溶液的高粘度造成

相比之下

我们上节课说过

RNA由于是单链分子

多呈球状

因此RNA溶液的粘度

就远远低于DNA溶液

同样如果DNA发生变性或降解

溶液的粘度也会大大降低

不同大分子的浮力密度不同

DNA一般在1.7左右

大约等同于8M的CsCl

RNA由于在核糖上多一个羟基的氧原子

沉降系数稍大于DNA

为1.8左右

蛋白质沉降系数为1.35-1.40

相同分子量但结构不同的

DNA沉降系数也不相同

同样的DNA分子变性后沉降系数增加

因此可用利用

密度梯度离心来分离纯化核酸

氯化铯溶解度高

可制成高密度溶液

所以最为常用

嘌呤和嘧啶因具有

共轭体系而有强紫外吸收

核酸在260nm有紫外吸收峰

由于吸收峰值的高低

直接与碱基数量相关

因此可以根据核酸

在260nm处的吸收峰值计算核酸的浓度

另外

由于蛋白质中含有芳香族氨基酸

其特征性的吸收峰在280nm

测定OD260/OD280

纯DNA为1.8

RNA为2.0

如果含有蛋白质

比值会明显下降

因此也可以根据样品在260nm和280nm处

吸光度的比值来确定样品核酸的纯度

上次课我们提到过DNA分子

在横向和纵向上分别通过

碱基对的氢键相互作用

和碱基对的疏水相互作用来维持稳定

因此

凡是能够破坏这些相互作用的因素

都会造成DNA分子结构的破坏

在强酸溶液中

核苷酸之间的磷酸酯键

碱基与核糖之间的糖苷键

这些共价键都可以被水解

而在碱性溶液中

共价键不受影响

主要改变的是嘧啶和嘌呤的酮式

和烯醇式互变异构

从而影响碱基的互补配对

因此在碱性溶液当中

DNA双螺旋解链成单链

我们把这个过程称为DNA的变性

一切影响碱基对的氢键配对的因素

但不破坏DNA的一级结构的因素

都可以造成DNA的变性

例如加热

溶液的pH值

尿素

有机溶剂

甚至脱盐都可引起DNA变性

DNA变性后粘度降低

密度和吸光度升高

紫外吸收改变是DNA变性的标志

当双链DNA解链时碱基外露增加

紫外吸收明显增加

称为增色效应（Hyperchromic shift）

因此动态检测DNA溶液

在260nm紫外吸收峰值的变化

可以推断溶液中DNA分子的变性情况

在加热变性的情况下

通常将50%DNA分子

变性时的温度称为熔解温度

简称（Tm）

一般DNA在生理条件下的熔点

在85-95度之间

熔解温度受许多因素影响

溶液的pH值

离子强度都会影响熔解温度

同时

熔解温度与DNA分子的大小

DNA分子的复杂程度

G-C碱基对含量正相关

一旦造成DNA变性的因素去除

变性的DNA可以通过

碱基互补配对重新结合为双链

这个过程称为称为复性

DNA复性由局部序列

配对形成双链核心的慢速成核反应开始

然后经过快速的所谓拉链反应而完成

DNA的复性速度

与其初始浓度C0及复杂度有关

当温度

离子强度等其他条件固定时

一定浓度的DNA

复性快慢仅与其复杂度有关

可用来计算基因组的复杂度

只要存在互补配对的碱基

不同来源的DNA分子

可以在变性后复性

甚至DNA和RNA分子

之间也可以复性

形成DNA/RNA杂合双链

这个过程称为分子杂交

我们可以通过合成具有

特异序列的DNA或者RNA探针

来检测DNA或RNA样品中

是否存在与探针互补的靶序列

这也是Southern Blot（DNA杂交）

和Northern Blot（RNA杂交）的基础

在此基础上

再结合高通量的芯片制作技术

就形成了用于不同的研究目的

的各种基因芯片

这些我们还会进一步地

在分子生物学实验课中详细讲解

上一章节我们讲过

核酸的一级结构就是碱基的序列

搞清楚这些碱基的序列

是人类解读遗传密码的前提条件

后面我们要讲到的

人类基因组计划

就是基于Sanger 测序法

Sanger法测序

由一套四个单独的反应构成

每个反应系统包含

四种脱氧核苷酸 (dNTP)

可以正常合成DNA

同时每个反应系统加入

四种不同的荧光或者

同位素标记的双脱氧核苷酸 (ddNTP)

由于ddNTP缺乏

延伸所需要的3-OH基团

使延长的寡聚核苷酸选择性地在G

A T或C处终止

然后以目的片段为模板

在DNA聚合酶的催化下

从引物处起始开始复制DNA

当遇到双脱氧核苷酸时反应就会终止

通过对反应体系中

dNTP 与 ddNTP 相对浓度的调节

使反应扩增得到一组

长几百至几千碱基的

终止于不同的核苷酸位点的产物

接下来用凝胶电泳

把他们分四个泳道

电泳并按片段长度分开

然后通过放射自显影或荧光检测

就可以按片段长度读出相应的碱基序列

在此基础上

后来对Sanger 测序法的不断改进

包括

用荧光标签替代放射性标记

用毛细管电泳替代普通的平板电泳

再加上对各种溶液

流体的自动操作技术

大大简化了这些测序的准备工作

整个测序流程开始

向更高水平的自动化和高通量发展

最终使得人类基因组计划的提前完成

关于人类基因组计划

我们后面还会有专门的章节讲解

这次课就先讲到这里

谢谢大家