分子荧光光谱的基本原理在线视频

大家好

我们今天来讲一种新的分析方法

分子荧光光谱

课程内容包括分子荧光的基本原理

荧光强度的影响因素

荧光光谱的特征与定量分析

荧光分光光度计的构造四部分内容

本节课我们将学习前两部分

荧光与我们的生活

工作关系密切

如大家熟悉的日光灯管

是由于灯管内气体放电产生的

紫外线激发管壁上的发光粉发出可见光

又如荧光棒

是过氧化物和酯类化合物发生反应

产生的能量传递给荧光染料

再由染料发出荧光

又比如在生命科学研究中

最常见的死-活细胞染色试剂盒

通过异硫氰酸荧光素染色活细胞

发射绿色荧光

以及碘化丙啶染色死细胞

发射红色荧光

借助荧光显微镜

可直接观察细胞的死-活情况

分子荧光是一种分子发光行为

处于基态的分子吸收能量

比如电能热能化学能或者光能等

被激发到激发态

然后从不稳定的激发态

返回到基态并发射光子

此现象称为分子发光

最常见是光致发光

按延迟时间可分为分子荧光和分子磷光

分子发光包括两个过程

首先是激发过程

分子吸收能量

电子从基态跃迁到激发态

然后是发射过程

电子从激发态返回到基态

发射光子

下面我们来介绍一下光谱中的电子能级

什么是激发单重态

电子自旋配对

自旋方向相反

净自旋为0

谱线多重性为1

以S1、S2…表示

什么是激发三重态呢

电子自旋不配对

自旋方向相同

净自旋为1

谱线多重性为3

以T1、T2…表示

当分子吸收能量的时候

可以从基态跃迁到激发单重态

但不能直接跃迁到激发三重态

过一段时间后

激发单重态上的电子可能发生自旋翻转

从而跨越到激发三重态

根据洪特规则

激发三重态能量比激发单重态要低

寿命要长

分子荧光或磷光的产生过程包含了无辐射跃迁和辐射跃迁

其中

无辐射跃迁包括振动弛豫

内转换

系间跨越和外转换四方面

什么是振动弛豫呢

振动弛豫是处于激发态的

分子因碰撞失活

从高振动能级跃迁至低振动能级的过程

其特点是时间短约10-12s

只能在同一电子能级内进行

效率高

大多数激发态分子都处于最低振动能级

我们再来看什么是内转换

相同多重态的两个电子能级

发生振动能级重叠时

激发态分子由高电子能级

无辐射跃迁至低电子能级的过程

其特点是

两个激发态电子能级具有相同的多重性

比如从第二激发单重态

到第一激发单重态

或者从第二激发三重态

到第一激发三重态

通常

激发态电子通过振动弛豫

和内转换这两个过程返回到

第一激发态单重的最低振动能级

下面我们来介绍一下什么是系间跨越

两个不同多重态之间的跃迁是禁阻的

比如从第一激发单重态不能

直接跃迁到第一激发三重态

但是

当不同多重态的两个电子能级

重叠较大的时候

激发态电子的自旋方向发生翻转后

可通过自旋-轨道耦合产生无辐射跃迁

此过程称为系间跨越

其特点是

发生在不同多重态之间

含有重原子如溴

碘等的分子

或者溶液中存在氧等顺磁性物质

容易发生系间跨越

使荧光减弱 磷光增强

我们再来看一下什么是外转换

激发态分子与溶剂

或其它分子相互作用发生能量转换

使荧光或磷光强度减弱甚至消失的过程

也称“熄灭”或者“猝灭”

其特点是

常发生在第一激发单重态

或第一激发三重态的最低振动能级

返回基态的过程

系间跨越和外转换

这两个过程通常使荧光减弱甚至消失

辐射跃迁包括发射荧光和发射磷光

受光激发的分子经振动驰豫

内转换到达第一激发

单重态的最低振动能级

以辐射形式失活回到基态发射荧光

其特点是发射波长大于激发波长

寿命短 约10-9 ~ 10-6 s

当电子返回到基态的不同振动能级时

荧光谱线就会出现几个非常接近的峰

如果激发态电子改变自旋方向

通过系间跨越从

激发单重态跃迁至激发三重态

再经振动弛豫跃迁至第一激发三重态的最低振动能级

然后以辐射形式回到基态则发射磷光

其特点是磷光波长比荧光长

寿命长 达到10-4 ~ 10 s

但磷光在室温下很少产生

仅在很低的温度

或黏性介质中才能观察到

因而很少用于分析

这是分子荧光和磷光的发生过程示意图

首先

分子吸收能量后

基态上的电子跃迁至第一、第二

甚至更高的激发单重态

然后通过振动弛豫和内转换损失能量

跃迁至第一激发单重态的最低振动能级

最后这些电子以辐射形式失活回到

基态的各个振动能级发射荧光

在此期间

如果激发单重态的电子发生自旋翻转

跃迁至激发三重态

再通过振动弛豫和内转换

从第一激发三重态的最低振动能级

返回到基态的各个振动能级则发生磷光

不管是荧光还是磷光

辐射的光子都是有寿命的

荧光寿命是指除去激发光源后

分子的荧光强度降低到

最大荧光强度的1/e所需的时间

常用τf表示

荧光强度的衰减符合指数规律

Ft为t时间的荧光强度

F0为初始最大荧光强度

k为衰减系数

当时间达到荧光寿命时

荧光强度等于初始

最大荧光强度的(1/e)倍

由此得到1/e=e-kτf

也就是k=1/τf

由荧光强度衰减公式两边取自然对数得

ln(F0/Ft)=kt

可以发现

直线斜率就是1/τf

从而求得荧光寿命

磷光的寿命同理求得

比荧光要长

荧光或者磷光的发射

存在一个量子效率问题

量子效率等于发射的荧光量子数

除以吸收的光量子数

一般物质的量子效率在0~1之间

量子效率越高

荧光强度就越强

量子效率的大小取决于

分子的化学结构及环境

比如温度pH、溶剂等

一般情况下

量子效率不随激发光波长而改变

但如果形成的激发态会导致

化学反应或者系间跨越与内转换的竞争

则可能使量子效率受到影响

影响荧光强度的因素有内因和外因

其中

内因包括共轭结构

刚性结构

取代基

自吸收和自猝灭

第一

共轭结构的影响

具有—*跃迁结构

共轭度越大荧光越强

比如大多数芳香环或者杂环物质

第二

刚性结构的影响

分子刚性越强振动越小

与其它分子碰撞失活的机率越低

荧光量子效率就越高

比如芴和联苯的分子结构相似

都有两个苯环

但芴的两个苯环之间

形成一个五元环的结构

刚性大

荧光量子效率为1

而联苯的两个苯环通过单键相连

单键可以自由旋转

因此分子刚性小

荧光量子效率低

仅为0.18

（3）取代基的影响

给电子的取代基使p-共轭增加

荧光增强

比如羟基

烷氧基

氨基

氰基等

吸电子的取代基降低共轭

荧光减弱甚至消失

如羧基、羰基、硝基、亚硝基

卤代物等

如果取代基对电子共轭作用小

则对荧光影响不大

如烷基、磺酸基、氨基阳离子等

（4）自吸收的影响

如果发射光谱的波长

与其激发光谱的波长有重叠

那么溶液就可以吸收自身的荧光发射

使荧光强度减弱

（5）自猝灭的影响

分子间碰撞使能量无辐射转移

将导致荧光发生自猝灭

自淬灭随溶液浓度的增加而增加

影响荧光强度的外因包括溶剂效应

温度pH值

荧光试剂和荧光猝灭剂

（1）溶剂的影响

溶剂极性增加

—*跃迁能级差变小

激发波长和发射波长均发生红移

跃迁几率增加

荧光强度增强

另一方面

如果溶剂粘度降低

分子间碰撞机会增加

荧光减弱

（2）温度的影响

温度增加

内外转换增加

同时溶剂粘度下降

荧光强度减弱

（3）pH值的影响

荧光物质本身是弱酸或弱碱时

不同pH值会改变分子和离子间的平衡

从而影响荧光强度

（4）荧光试剂的影响

在弱荧光或无荧光的物质中加入荧光试剂

比如荧光胺

邻苯二甲醛

丹酰氯等

会使原来物质产生强荧光

（5）荧光猝灭剂的影响

加入引起荧光猝灭的物质

如卤素离子

重金属离子

氧分子

可使荧光消失