9.2 Modern food microbiology testing technology (Ⅱ)在线视频

下面我们来看第三大类快检方法

基于核酸扩增原理的

PCR 检测方法

同学们我们先来了解一下 聚合酶链式反应（PCR）技术

这是一种在体外模拟生物扩增 DNA 分子

这是一种在体外模拟生物扩增 DNA 分子

的分子生物学技术

我们都知道 DNA 为双链螺旋结构

PCR 扩增时主要经过四个步骤

首先 DNA 在 90-96 摄氏度高温时会发生变性

解旋解链变成单链

然后在 60-65 摄氏度时退火

此时引物与 DNA 模板结合

形成局部双链

再调整温度至 70-75 摄氏度

此时 DNA 聚合酶沿着磷酸到五碳糖（5'-3')

的方向延伸合成互补链

从而使 DNA 大幅增加

这个过程重复n次后

DNA 就可快速扩增 2ⁿ倍

我们可以通过以下几种方式观察 PCR 扩增产物

首先是凝胶电泳 pcr 技术

它以凝胶为载体

利用带电粒子在电场中移动速度不同

从而起到分离的作用

再和模板做对比就可以得知

是否有目标 PCR 扩增产物 及其片段大小

第二种是实时荧光定量 PCR 技术又叫 Real-Time PCR ,

它是利用荧光信号实时监控核酸扩增的技术

和凝胶电泳 pcr 不同点在于

它在扩增体系中加入了荧光基团

现在主要使用 TaqMan 荧光探针

这种荧光基团含有一个报告基团 R 和荧光淬灭基团 Q

当 DNA 片段及探针完整时

R 所发射的荧光能量被Q 吸收

此时没有荧光

当 DNA 扩增进入复性和延伸阶段时

探针被 Taq 酶水解

报告基团 R 与荧光淬灭集团 Q 分开

此时报告基团发出荧光

仪器可进行一次荧光信号的探测收集

这样在扩增过程中,

荧光信号随着 PCR 产物的

增加而增强

通过仪器实时记录每个循环后

荧光信号的变化和数据

我们确定未知样品的 扩增循环次数

即 C(t)值 与标准曲线对比

就可以推算出其初始量

第三种是等温扩增 PCR 技术

与刚刚提到的两种方法最大的不同便是

在于这种 pcr 无需改变扩增反应温度

而是利用特殊的酶在同一温度下

短时间内完成扩增过程

这样扩增过程更加简单

能做到在解离的同时延伸

等温扩增 PCR 技术条件简单,

对温度和仪器要求较低 检测速度快 灵敏度高

可以大大缩减测试时间

适合现场检测

数字核酸扩增技术是第三代的PCR技术

它利用微滴化方法

基于单分子PCR扩增

并通过收集荧光信号来对核酸进行定量

是绝对定量最新的方法

首先制备样品 将 DNA/RNA样品 引物和探针

与 ddPCR预混液混合

其次是微滴制备

将反应体系添加至微滴发生器芯片的小孔中,

产生多个油包水的微滴

将微滴转移至 96孔 PCR反应板中

并密封进行微滴PCR扩增

并收集成功扩增微滴的荧光信号

最后通过机器进行荧光信号分析

根据阴性微滴的比例

定量 DNA/RNA 浓度

数字核酸扩增技术和之前三种 PCR 技术对比

普通的 PCR 只能做定性分析

实时定量荧光 PCR 可以做到定性和相对定量

但需要和标准进行对比

而数字 PCR 无需标准品

可直接进行定量分析

也可实现稀有序列富集

具有优秀的准确度 精密度和重复性

由于高度细分 使得其反应体系也对 PCR 抑制剂的容忍度更高

下面我们来看第四大类快检方法:

基于质谱技术的

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱 简称飞行质谱 也叫MALDI-TOF-MS

岛津工程师田中耕一和美国科学家约翰·芬恩

一起发明了对生物分子的质谱分析法

他们发现使用基质可分析生物大分子如蛋白质

并因此获得了 2002 诺贝尔化学奖

飞行质谱基于这个方法进行设计

能测试微生物的特定蛋白图谱

从而实现对微生物的鉴定

飞行质谱工作分为几步

首先将样品分散在基质分子中并形成晶体

用激光照射晶体 基质从激光中吸收能量

样品解吸附 基质-样品之间发生电荷转移

样品瞬间气化并离子化

随后 电离的样品在电场作用下

飞过真空的飞行管

不同质量离子到达检测器的飞行时间不同而被检测到

正如这个动画所示

荷质比更小的离子达到检测器的时间更快

根据离子的荷质与飞行时间成正比

来分析得到的不同的谱图

测得样品蛋白质质量指纹图谱

然后我们在计算机中检索特征性质质谱峰数据库

或与已知微生物的质谱峰

就可实现对微生物的快速鉴定

现在各检验机构和实验室常用的

全自动免疫荧光酶标仪则是综合运用固相吸附

酶联免疫 荧光检测和乳胶凝集等多种方法

来快速鉴定食品及环境样本中的致病菌

可大大地减少劳动量 缩短检测时间

其原理是利用夹心ELISA 方法,

将抗体提前包被在固相接受器上,

其它试剂固定在试剂条上, 形成即用型试剂,

插入仪器中, 然后由机器分担所有工作,

直至打印报告

一般经 48h增菌过程后,

多数检测可于 50min 内结束

同学们 经过我的介绍

大家是不是对现代食品微生物检测技术有所了解了呢？

最后我们给大家归纳一下这些方法的优缺点

传统培养基改进的显色培养基和载体培养基

优点是显色明显 易于识别

特别载体培养基是即用产品

可大大缩短检测时间

但是有一定假阳性率

有些样品基质不适合用载体培养基检测

免疫分析法灵敏度高 特异性好

可完成样品的高通量筛检

操作简便 应用范围广

但有一定假阳性率

目前该方法无国标支持

测试前期仍需增菌 在国内较少使用

PCR 技术灵敏度高 特异性好

可实现样品的高通量筛检

也可定量测试 目前新方法中应用较广

但样品前期仍需增菌

对人员专业性及设备要求较高

也有一定假阳性率

飞行质谱准确度高 灵敏度高

操作需时短 可高通量筛选 受样本中杂质的影响较小

耗材损耗少 技术较新 但仪器昂贵

国内菌种数据库数据少

目前还没有国标支持

生物芯片 基于代谢学的 ATP 生物荧光法

电子鼻等其他方法自动化程度高

操作简便 效率高

但受仪器或硬件发展等因素影响

国内未广泛研发应用

现代食品微生物检测技术在改善了

我们的检测条件同时

又有各自的优势和局限性

但随着科技的不断进步和完善

食品微生物的快检方法在不久的将来

必将取得长足的进步 为我们的食品质量安全建设添砖加瓦！

谢谢聆听！