7.4 Detection of Genetic Materials在线视频

我们都知道

不同病毒的形状

形态或大小也不尽相同

但这些差异

只是不同病毒遗传物质差异的

外在表征

事实上

病毒的遗传物质编码了

所有蛋白质以及病毒形状

就像设计蓝图一样

如果能测定遗传物质

我们不仅可以确定其病毒身份

还能准确得知它是哪种病毒

在讲解检测技术之前

我们需要了解一下基因相关的知识

遗传物质通常有两种形式

RNA或者DNA

两者的区别在于

相比于RNA

DNA的主链部分没有氧原子

但这也让DNA分子更加稳定

不管怎样

RNA 和DNA

都遵从简单的碱基配对原则

也就是在DNA中

碱基G和碱基C配对

碱基A和碱基T配对

在RNA中则是碱基U和碱基A配对

这个碱基互补配对原则

构成了基因的基础

基于这个原则

只要有一条基因链

不管是DNA、RNA还是其他遗传物质

都可以通过碱基互补配对原则形成

例如

一个单链DNA

可以通过碱基互补配对

得到另一条与之对应的DNA单链

而这条新形成的单链

通常被称作第一条链的互补链

以此类推

我们就可以用DNA模板链得到RNA

也可以用RNA模板链得到DNA

病毒的所有遗传物质

也就是病毒基因组

可以属于这七种不同形式中的任意一种

它可以是由DNA组成

也可以由RNA组成

可以是单链也可以是双链

如果是单链

它可能和用于形成

病毒蛋白质的mRNA有一样的基因序列

也可能是它的互补序列

例如

假如病毒的基因组是正义链RNA

在这种情况下

它就有和mRNA一样的基因序列

但当它需要自身复制时

它就要先转化为反义链RNA

也就是病毒基因组的互补序列

之后

以这条互补序列为模板

病毒就可以产生得到

很多自身基因组的复制

除此之外病毒基因组还有其他形式

我们在此不做讨论

冠状病毒是一个单股正链RNA病毒

它自身的染色体可以

直接产生病毒蛋白质

起到信使的作用

或者像我之前提到的

它可以产生一条反义链基因

这条RNA互补链可

以以自身为模板

得到病毒基因组

这个从单股正义链RNA

到反义链RNA的再生过程

是通过RNA依赖性的RNA聚合酶实现的

这一聚合酶是很多药物的目标靶点

我们需要收集病毒

来得到它的基因组序列

我们可以从BALF中的到病毒

这是一种用来冲洗下呼吸道的液体

首先

通过使用细胞病理效应分析

来确定是否存在病毒

一旦确定病毒存在

我们就可以进行成熟基因提取工作

要想重建病毒基因组

我们需要确定整个基因组的序列

但是病毒基因组通常都很长

没有现有技术可以直接确定其序列

因此我们需要采取另一种方法

即通常所说的鸟枪法或鸟枪测序法

这种方法不是一次性测序整个基因组

而是把基因组分成小片段

重要的是

这些小片段之间会存在各种各样的重叠

基于这些重叠

我们把它们重新组合成重叠群

然后再进一步组合成完整的基因组

并且这里的小片段都足够小

可以用现代DNA测序仪测序

在这里提醒一下

这些片段中部分DNA 或RNA

会来自人体细胞

和其他生活在人体呼吸道中的微生物

所以这些序列

会与已知的基因组进行比对

并需要在重组未知的

病毒基因组之前进行过滤

测序DNA片段的技术

被称为短读测序技术

或下一代测序技术

有时也叫作二代测序技术

它通过一种叫做

合成测序的生物化学过程作用

基本上就是

我们把每个片段固定在一个固体表面上

然后往其中加入一个核苷酸

如果这个核苷酸与被固定片段互补

生成链中就会包含它

不同的碱基如ACTG

被偶联上了不同的颜色

所以

所以如果我们从上面看

根据颜色

就可以推断出整合了哪种核苷酸

这样我们就能知道被测片段的互补碱基了

如果片段的每个位置都继续这个过程

我们就可以得到所有片段的全部序列

单个分子产生的信号太弱

在实际应用中无法被探测到

在实际操作中

单个片段在被测序之前

会通过设备被放大成簇

在这里我会介绍两种商业实操解决方法

第一种方法由Lumina公司采用

名叫Bridge PCR

我们之后会讨论PCR这种方法

现在大家只需要知道

当一个片段被固定在表面

它就可以在附近形成互补链

并形成一群序列完全相同序列的片段

并且片段还可以变成环形DNA

你可以想象一下

一条DNA互补链绕着圈转

并复制产生了很多

完全相同的环形DNA序列

这会形成一个DNA群簇

之后会嵌入到一个固体表面上进行测序

有了全部的基因组序列

我们就可以把它拿来和已知病毒

微生物的序列进行比对

我们就是这样发现

新冠病毒和爆发于2003年的

非典病毒关系紧密

而蝙蝠会携带一些冠状病毒

此外

通过比对不同部分的基因序列

我们还可以找到它们的相同点

而且我们还能识别出了一些

十分保守的序列区域

也就是说不同冠状病毒

这个区域的基因序列是相似的

比如ORF1b基因

这是一种RNA依赖性RNA聚合酶

也是一个对病毒来说十分重要的基因

所以我们也可以用其他

冠状病毒的已知基因和相似性

来评定新基因或功能变化的轨迹

例如

有一个区域和一种已知病毒的S基因对应

这种S基因

也就是我们所说刺突基因

用来编码冠状病毒表面的刺突蛋白

而刺突蛋白负责细胞的对接和进入

我们也可以对比

不同区域的基因序列

进而推测出它

尤其指随着时间推移

是如何传播的

例如，我们可以看到

在东亚和南亚地区的

新冠病毒毒株更相近

而欧洲和美国地区检测出的毒株更加相似

十分重要的是

这种对比

或者叫做对病毒进化的追踪

可以让我们看到

随着病毒持续传播而产生的突变

我们因此就可以知道它的变异有多快

以及哪个基因变异了

这对于药物研发

及开发可靠的检测方法都十分重要

当然

我们不用通过确定每个时间段

每个个体的基因组来测定病毒

我们只需要测试在COVID-19中最保守

突变最少的序列的存在

这也可以帮我们

区分新冠病毒和与它高度相关的冠状病毒

如非典病毒和MERS病毒

各国都根据这一原则

设计了自己的基因检测指南

例如在中国

中国疾控中心

一直提倡检测ORF1ab基因和N基因的小片段

通过确定它们的存在来检测病毒

用于测定DNA小片段的技术

叫做逆转录聚合酶链反应

简称逆转录PCR或RT-PCR

正如我们刚才所说

因为冠状病毒是单链DNA病毒

所以需要进行逆转录

它们的基因组需要先变成DNA

我们使用一种叫做引物的东西

也就是一个短的DNA序列

这个序列可通过化学合成得到

它会与RNA基因组形成碱基配对

然后我们用一种逆转录酶

让这个DNA复制

用RNA基因组作为模板得到它的互补链

因为这段DNA的序列和RNA基因组互补

它通常被称作cDNA

接下来我们会放大cDNA的片段

检测它是否包含目标序列

通常情况下

我们取样只能收集到很少一部分病毒

而且DNA太小了

我们看不到它

所以我们必须把DNA放大到足够观察的大小

我们会再次用到引物来放大DNA

把引物结合到我们想放大的区域

一旦结合

我们会用DNA依赖性的DNA聚合酶

也简称聚合酶

进一步进行链的延伸

得到新的DNA

接下来到了十分重要的部分

我们需要把两条链分开

以便引物与它们再次结合

所以把DNA加热到95度

把模板DNA和新形成的DNA链分开

然后降低温度

因为引物相对于原始DNA

与模板DNA的接触高很多

它们会争相与DNA模板结合

然后我们升高温度

链的延伸就会开始了

这被称作循环

在这样的循环中

DNA的数量会翻倍

如果持续进行30或35次循环

DNA就可以放大40亿倍

而这种循环和指数

放大的机制会让PCR十分敏感

在一次循环中

首先要完成的就是温度的改变

温度的改变

可以由珀尔帖效应（Peltier Effect）实现

通过向两个不同的导体注入大电流

从而通过加热或冷却任一方式实现净传热

这个过程需要一个很特别的设备来实现

叫热循环仪（PCR仪）

这是仪器最贵的一部分

PCR不是定量的

但是有时知道样本中的

病毒含量是很有用的

病毒数量的测定

则会用到一种叫做定量PCR的方法

也叫Q-PCR

这个方法的诀窍是

添加一种可以优先结合双链DNA的染料

当这种染料与双链DNA结合时

它可以发出较强的荧光

而只有一条单链DNA或单链核苷酸时

它发出的荧光就会弱一些

所以在循环过程中

我们可以加入一个测量DNA浓度的环节

在循环过程中

随着DNA的放大

越来越多的绿色荧光染料会和DNA结合

所以我们能读出每个循环中的荧光

并看到荧光会越来越多

随着循环次数的增加

荧光也会持续增多

输入DNA越多

荧光信号越早通过预设阈值

相应的

输入越少

通过预设阈值越晚

所以我们会继续追踪荧光信号

通过阈值的周期

这个周期数则被称之为Ct值

因为Ct值直接和输入材料的量成正比

所以它是一个很好的指标

利用Ct值

我们可以对输入材料进行定量测量

因为Q-PCR需要荧光测量

所以需要更昂贵的设备

我们知道和目标序列相比

引物二聚体长度不同

序列组成也不同

所以我们可以在扩增结束后

加热这些混合产物

我们知道DNA在较高的温度下才会解旋

当DNA解旋后 我们可以看到

绿色荧光SYBR green的信号曲线开始下降

因为绿色荧光基团会与DNA分离

之后我们可以分析

不同温度下的荧光信号

因为引物二聚体较短

所以会在低温时首先解旋

如果我们通过下降的荧光信号进行求导

我们就能求出引物二聚体相对应的信号

而目标序列相对较长

所以在较高温度下才会解旋

如果再进行求导

可得出目标序列的对应信号

我们称这一过程为熔解曲线分析

通过熔解曲线分析

我们可以知道样本中

是否含有目标序列

有时信号超过了Ct值

说明样本中没有目标序列

只有引物二聚体

这种方法能帮助我们减少假阳性的产生

除了假阳性 我们也经常听到

核酸检测结果为假阴性

就病毒传播角度来说

假阴性的后果可能要比假阳性严重

但其实PCR灵敏度很高

即使只有一个DNA分子

也能检测得到

但是有其他因素限制了检测的灵敏度

比如 病毒承载量

这张图标显示了上呼吸道的

ACE2基因表达低于下呼吸道

我们知道新冠一般会影响肺部和下呼吸道

但是检测时我们一般在上呼吸道取样

因此病毒承载量会大幅减小

有时样本中甚至不含病毒

或者只含有极少的病毒样本

采样不专业也会导致我们

得到错误的结果

此外 样本还会被送至

专业PCR实验室进行检测

在运输过程中也会出现样本流失的情况

鉴于上述因素

在进行核酸检测时

每人的假阴性概率约为30%

多次测验可降低假阴性的概率

例如 如果假阴性概率为30%

那么进行四次检测就可将准确率提升至99%

此外

因为PCR需要在指定实验室进行

病毒需要从取样地点

转移到PCR实验室

而这个过程也可能造成病毒丢失

以上因素都可能造成虚假阴性结果

据统计

假阴性结果比率可达到30%

我们可以通过

做多重测试来减少假阴性

比如对于一个阳性样本

如果每次测试得到

假阴性结果的比率是30%

那么测4次就基本可以保证

得到一个可靠的阳性结果