当前课程知识点:普通生物学 > 第二章 分子生物学基础 > 第三节 生物技术及其应用 > 2.3.1 核酸的分子杂交
核酸的分子杂交
是定性或定量的检测
特异的RNA或DNA序列片段的
有力工具
它是利用核酸分子的
碱基互补配对原则而发展起来的
在碱性环境中加热
或加入变性剂等条件下
双链DNA之间的氢键会被破坏
也就是说DNA发生了变性
两条链就会解开形成两条单链
这时候
如果加入异源的DNA
或者RNA以单链的形式加入进去
并且在一定的离子强度和温度下保温
也就是说对它们进行复性
那么 如果异源的DNA
或者RNA之间的某些区域
可以跟模板上的基因相互补配对的话
那么在复性的时候
就可以形成杂交的核酸分子
在这里涉及到几个不同的名词
我们做一个简单的说明
变性 Denaturing
或溶解 Melting
是指DNA的两条链
分开成为单链的一个过程
而复性 Renaturing
是指两条分开的DNA单链
重新连接在一起
形成双螺旋结构的过程
而杂交 Hybridization
是指不同来源的两个互补
的核酸序列形成双链的杂交分子的过程
杂交分子是指DNA/DNA
RNA/ RNA DNA/RNA
这样的一些双链分子
核酸的分子杂交中
最为核心的组分
实际上是分子探针
或者叫Molecular probe
这样的分子探针既可以是克隆的
或者PCR扩增出来的DNA分子
也可以是人工合成的
寡聚核苷酸
或经体外转录获得的RNA分子
探针的要求必须是纯一的
不能够含有其他不同的核苷酸
为了保证通过碱基互补
来检测目的基因
探针必须要是单链分子
因为如果是双链分子
它们已经形成了互补配对
那么它们就不会杂交到目标的DNA上去
所以双链的DNA探针
在应用之前必须要加热
变性成为单链
然后才能用于作为DNA探针
另外 探针是带有标记的
因为探针的目的是
使得你原本不能被看到的DNA
被检测出来
所以常见的探针标记
会包括放射性同位素标记
如带有P32标记的DNA
或者非放射性标记
比如说用地高辛、生物素、荧光标记等等
根据所需要检测的基因的目标
和位置等等差异
核酸的分子杂交实际上可以包括为
几类不同的杂交
包括Southern blot,Northern blot
和in situ hybridization
或者也叫原位杂交
Southern blot用于检测
特定的DNA片段
分析DNA的结构
它是由科学家Southern
在1973年所设计
后来就根据他的名字而命名的
让我们根据这张图
详细的看一下Southern blot是怎么样进行的
首先
我们将带有目标条带的DNA
如基因组
切割成大小不同的片段
通过DNA凝胶电泳
在琼脂糖里分离成不同的独立的条带
我们想要知道的是
我们这个目标条带是在哪里
然后接下来
我们可以将琼脂糖里包含的DNA片段
因为琼脂糖里没办法对它进行直接的操作
那么为了找到这个DNA片段
我们需要把这些DNA片段
全部都从琼脂糖里
转移到一个支持介质
也就是我们用的
硝酸纤维素膜
以方便后续的整个杂交过程
这个过程就叫转膜
转膜可以设置如图中所示的装置
可以将凝胶先放置在一块海绵上
然后在凝胶的表面上加上
我们希望能够把DNA
转到上面去的这一层
硝酸纤维素膜
然后在上面再加上
滤纸以及很多用来吸水用的吸水纸
然后在上面再加以一定的重量
因为整个海绵被放在了一个
带有缓冲液的容器中
那么缓冲液
会因为上层吸水纸的作用
不断的从下往上移动
而在这个移动过程中
使得凝胶中的DNA也同时被带动
移动到上层硝酸纤维素膜上
就可以和膜发生紧密结合
而结束了转膜以后
带有DNA的硝酸纤维素膜
将会与被标记的探针一起孵育
杂交过程就将发生
当探针和目标DNA相结合以后
我们就再通过一些清洗
去除掉没有结合的
结合有目标序列的探针
最后根据探针的标记方式
比如说我们是用同位素标记的
我们可以用放射自显影
来检测膜上目标条带的位置
从而可以鉴定出
与探针可以互补配对的
这个核苷酸是位于
我们跑的凝胶电泳的哪个位置
这是Southern blot
Northern blot实际上与Southern blot是非常相似的
只是不同的是
他们在Northern blot过程中
用凝胶电泳分离的是RNA分子而不是DNA
整个过程中使用了
几乎和Southern blot完全一样的步骤
Northern blot可以帮助
我们检测细胞中
某一种RNA是否表达
它的表达的量有多高
它的RNA的大小
是否跟我们的预期一样
以及是否
我们可以检测到我们前面所说的可变剪接
因为它们会形成大小不同的RNA
其实
除了Southern blot,Northern blot外
科学家也是很幽默的
他们除了Southern Northern之外
他们实际上还根据这个命名提出了Western blot
Western blot是用于检测特定的蛋白质
而有了
Southern blot,Northern blot,Western blot以后
那么大家想想有没有人会提出Eastern blot呢
这个实际上存在的
你们可以自己百度一下
找到它是用来干什么的
另外一种常用的
核酸的分子杂交
是原位杂交 in situ hybridization
它的目的是为了观察在细胞标本
或组织标本中DNA
或RNA的表达及定位
为了方便检测
人们常常使用
荧光染料标记探针
直接与染色体上面的
某一特定位置进行杂交
确定目标基因
在染色体上的位置
所以这个技术也会被称为
荧光原位杂交
或者叫Fluorescent in situ hybridization
或者叫FISH
而图中显示出来的
我们可以看到这个染色体上的
这些荧光的点
实际上就是我们用FISH杂交
看这个荧光探针所谓的
所杂交在基因主上的位点
-绪论
--绪论
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-第一节 细胞概述
-第一章 细胞生物学基础--第一节 细胞概述
-第二节 细胞膜与物质的跨膜运输
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-第三节 真核细胞的结构
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-第四节 细胞的能量代谢
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-第五节 细胞的分裂与分化
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-第四节 人类基因组及其遗传疾病
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-第一节 高等植物体的细胞与组织
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-第三章 高等植物体的结构与功能--第二节 植物的生长
-第三节 植物的生殖和发育
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-第五节 植物生长发育的调控
--3.5.6 乙烯
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-第四章 高等动物体的结构与功能--第五节 内环境的控制
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-第四章 高等动物体的结构与功能--第六节 内分泌系统
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-第四章 高等动物体的结构与功能--第七节 神经系统与神经调节
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-第四章 高等动物体的结构与功能--第八节 生殖与胚胎发育
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