当前课程知识点：基础生物化学实验 > 第五章 物质的分离纯化 > 第二节 核酸的提取和检测 > 紫外分光光度法测定核酸
同学们大家好
今天我们将要介绍的是核酸
的紫外分光光度法测定
核酸包括
核糖核苷酸RNA和脱氧核糖核苷酸
DNA两类
他们分别是由核糖核苷酸和脱氧
核糖核苷酸以3'，5'-磷酸二酯键
相连形成的生物大分子
核苷酸是由核苷加磷酸组成
而核苷是由碱基和戊糖组成
由于碱基中嘧啶
嘌呤以及核苷和核苷酸
都具有共轭双键系统
致使他们在240~290nm
的紫外区有强烈的光吸收
最高吸收峰值出现在260nm
所以研究人员利用紫外检测仪
在260nm波长下测定核酸
的光吸收值A260
从而确定核酸的含量
核酸 紫外分光光度法
测定操作与之前蛋白质含量的
紫外分光光度法测定相似
只是波长不同
通常认为A260为1时
相当于双链DNA的浓度
是50μg/mL
单链寡核苷酸浓度是33μg/mL
单链RNA浓度是40μg/mL
下面你试着计算一下
样品中核酸的含量
假如这里有一个双链DNA的样品
其A260为0.8
那么该样品中DNA的浓度是多少呢
如果是单链RNA
对样品中的DNA浓度
是40μg/mL
如果是单链RNA的话
其浓度是32μg/mL
紫外分光光度法不仅能够
检测核酸的含量
还可以判断核酸的纯度
记得前面讲过DNA制备常常会发生
制备的DNA中有其他杂质
比如蛋白质 RNA等
蛋白质不仅在紫外280nm
有最大光吸收
而且在260nm也有一定的吸收
RNA最大光吸收也在260nm
研究人员常常以测定的A260与
A280的比值来确定核酸的程度
一般认为纯品RNA 该比值接近2.0
如果比值小于2.0
表明样品中有明显的蛋白质的污染
而纯品DNA该比值接近1.8
当比值大于1.80
可能样品中有RNA的污染
如果小于1.8可能有蛋白质的污染
此外
A260与230的比值也
常常用于核酸纯度的判定
纯DNA或者RNA的A260与
230的比值保持在1.8~2.2
若比值小于1.8
表明样品被糖类
盐类或者有机溶剂污染
样品需要纯化
由于常规分光光度计所适用
的比色杯体积比较大
很难对体积小
浓度低的核酸样品进行测定
因此目前微量分光光度计成为实验室
普遍使用的核酸测定仪器
常见的
微量分光光度计有多种
这里以ThermoScientific公司生产
的NanoDrop分光光度计为例
介绍核酸的微量测定
Nano Drop
是全波长的分光光度计波长范围
是220~750nm
可以检测的最小样品体积是1uL
如图片所示
这是基座
是样品放置的
部位
这是取样臂
打开取样臂吸取待测样品
将其置放在下部测量基座的表面
关闭取样臂如图所示
此时样品液滴会自动在上下
测量的基座之间形成液柱
如此就可以测量了
之后需要使用计算机上的操作
软件进行测量和数据获取
这就是计算机的测量结果界面
上面出现了测量数据
比如有样品的浓度654.9ng/μL
A260与A280
A260与A230的两个比值
恰好都是1.98
测量结束后
打开取样臂使用比较柔软的纸
擦去上下测量基座
表面上的样品溶液即可
下面我提一个问题
如果刚才测试的样品是DNA
依据获得的数据
你分析DNA样品的纯度
请思考一下
考虑A260与A280的比值
纯品DNA该值接近1.8
而测量的数据是1.98
说明样品中可能有RNA的污染
纯DNA样品260与230的比值
为1.8~2.2
这里测量的数值是1.98
表明样品没有糖类
盐类或有机溶剂的污染
通过这部分内容的学习
大家了解了紫外分光光度法
测定核酸的过程
明确了该方法不仅能够
测量核酸的含量
还可以通过获得的A260与280
A260与230两个比值
来判断核酸的纯度
谢谢大家的参与
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