凝胶过滤层析的操作过程和注意事项在线视频

同学们 大家好

前面的视频我介绍了

凝胶过滤层析的原理

并进行了凝胶种类的讲解

本视频我将继续介绍凝胶过滤层析的

操作过程及注意事项

凝胶过滤层析进行物质分离时

主要依据的是蛋白质分子的大小

因此并不像离子交换层析

亲和层析那样专一性较强

因此如何操作才能保证好的

分离效果就显得尤为重要

凝胶过滤层析技术的操作流程

包括

凝胶的选择 凝胶的预处理

装柱 平衡 上样

洗脱以及凝胶柱的后期处理

等多个过程

关于凝胶的选择

在上一个视频中

我已经进行了简单的介绍

这个视频我将从凝胶的预处理开始讲解

第一 先看凝胶的预处理

商品凝胶中的颗粒是干胶

而且凝胶颗粒也不完全均匀

使用前需要清除破碎的凝胶颗粒

并需要使胶溶胀

因此通过用洗脱液浸泡或者

沸水浴1~2个小时处理

在溶胀过程中禁止剧烈搅拌

以免凝胶颗粒破裂

如图片所示

凝胶溶胀后静置放置

在烧杯中可分为两部分

正常完好颗粒的凝胶

位于烧杯的下半部分

烧杯液体表面上浮着一层凝胶颗粒

这些是破损的颗粒要倾倒出去

保留完好凝胶颗粒

准备装柱

装柱时

首先在层析柱中加入1/3

柱高度的洗脱液

之后在搅拌的条件下

将溶胀好的凝胶颗粒缓慢

连续加入层析柱

当层析柱底面自然沉降的

凝胶颗粒达到1~2个cm高度的时候

打开层析柱下面出口的夹子

让洗脱液自然流出

同时继续搅拌

加入剩余的凝胶溶液

当自然沉降的凝胶颗粒积累到离

层析柱顶部3~5cm处时

关闭层析柱底部出口外面的夹子

停止装柱

现在让我们一起看看平衡过程

装柱完毕后

需要用3~5个柱床体积洗脱液

继续加入层析柱平衡洗脱

注意层析柱有凝胶颗粒的部分

不能出现气泡和断层

柱中的凝胶颗粒上表面

不能呈现凹凸不平

谈到层析柱床体积

我需要介绍四个概念

外水体积 内水体积

床体积和洗脱体积

内水体积是指凝胶颗粒中

孔道所容纳的洗脱液的体积

用Vi表示

外水体积是指层析柱中凝胶颗粒之间

空隙所容纳洗脱液的体积

用Vo表示

凝胶颗粒本身也有一定的体积

用Vg表示

而柱床体积是上述三个体积之和

洗脱体积是指从加入样品开始

直至某蛋白组分最大浓度出现的

所流出的洗脱液体积

用Ve表示

上样时凝胶平面要平整

用吸管吸去凝胶颗粒表面的洗脱液

打开层析柱下面的夹子

让多余的洗脱液流出

待层析柱

凝胶上表面洗脱液

刚好全部进入凝胶时

关闭层析柱下面的开关

缓慢加入样品

打开层析柱下面的开关

待样品刚好全部进入层析柱时

关闭层析柱下面的开关

在沿层析柱管壁加入少量洗脱液

清洗管壁上的样品

打开层析柱下面的开关

待样品再一次全部进入层析柱时

缓慢加入洗脱液

洗脱液要高于层析柱

凝胶上面约3cm左右

开始洗脱

如果上样时凝胶颗粒

表面呈现凹凸不平

则需要用玻璃棒轻轻搅拌凝胶表面

待凝胶颗粒重新自然沉降

形成平整的凝胶平面后

再加样

现在进行到洗脱与样品收集的步骤了

如图所示

将层析柱下面的塑料

细管与恒流泵相连

从恒流泵出来的塑料管与

紫外检测仪相连之后

连接紫外检测仪与部分收集器

用洗脱液进行洗脱

根据紫外检测仪显示结果

进行样品组分收集

部分收集器中每管收集

液体1~2毫升

最后是凝胶柱的后处理

为了防止凝胶层析柱被细菌侵染

在短期不使用的情况下

需要加入抑菌剂

例如可以加入0.02%的叠氮化钠

或者0.01%~0.02%的三氯丁醇

在凝胶柱长期不使用的情况下

也可以经过处理

将凝胶处理形成干胶进行保存

凝胶过滤层析的分离效果

会受到哪些因素的影响呢？

层析柱的长度和粗细对分离效果

有很大的影响

柱子越长分离效果越好

但是增加柱长也会增加样品的稀释度

降低流速

在相同长度下

柱子越粗

管壁效应越小

分辨率会相对越好

通常情况下柱长度柱直径比值

为25~100比1

比值越高 分离效果越好

由于流速 柱子灌注

均匀性等问题

一般柱层析长度不超过1m

如果脱盐操作分辨率要求不高

可选择较短的柱子

上样样品体积对分离效果

也有很大的影响

加样体积越小

分离效果越好

上样量一般控制在分析型柱子

上样量是床体积的1%~4%

而制备型柱子上样量是

床体积的25%~30%

洗脱液流速也是影响因素之一

实验时最好使用恒流泵

以维持流速恒定

否则对于机械强度较低的凝胶

就会产生凝胶被压紧

而使柱床堵塞的现象

最后我们来谈谈Sephadex G-25

该层析凝胶的分离范围是

相对分子量1000~5000之间

用途是除盐

就是将大分子和小分子物质分离开来

记得之前谈到过盐析

假如通过盐析

我们获得了含有目标蛋白质的

蛋白样品混合物

当要继续进行下一步的分离步骤时

样品中的硫酸铵将会对

后续操作产生影响

为此需要去除样品中的硫酸铵小分子

这个过程被称作除盐

除盐的过程可以通过透析

或者Sephadex G-25层析柱完成

让我们一起看看如何除盐

一般情况下蛋白质相对分子量

都大于5000

而硫酸铵的分子量仅有132.14

如图所示将硫酸铵分子比作红色小球

由于它分子量小

可以任意进入凝胶颗粒

蛋白质分子比作绿色小球和黄色小球

由于分子量大

无法进入凝胶颗粒

而直接被洗脱下来

收集先被洗脱出来的蛋白部分

如此就能达到除盐的目的

有关Sephadex G-25除盐的知识点

曾两次被作为全国研究生

入学统一考试

农学门类联考题

分别出现在2009年和2012年

题目如下

2009年的题目是

酶纯化实验中

通常先用硫酸铵作为分级沉淀剂

再用Sephadex G-25凝胶柱层析法

从沉淀酶液中除去硫酸铵

请问与其他中性盐沉淀剂相比

用硫酸铵作沉淀剂有何优点呢

如发现

柱层析后酶的总活性

较纯化前明显升高

可能的原因是什么呢

柱层析时湿法装柱的

注意事项主要有哪些呢？

2012年的题目用

葡聚糖凝胶G-25

分子筛层析去除蛋白质溶液

中硫酸铵的实验原理是什么

还可以用哪一种实验方法

达到同样实验目的

写出方法的名称即可

请同学们根据视频内容的学习

试着回答

答案附在文本文件中

以上就是本视频的主要内容

下面让我小结本视频

在这个视频中我首先讲解了

凝胶的预处理

装柱平衡上样洗脱

及凝胶柱的后期处理过程

此后说明了影响凝胶过滤层析效果的因素

及凝胶过滤层析的操作注意事项

最后简单介绍了Sephadex G-25

除盐与考研题