核酸琼脂糖凝胶电泳的原理在线视频

同学们好

我是中国农业大学生物学院的韩海堂

通过DNA的提取实验

同学们已经掌握了DNA提取的方法

那怎样证明我们成功提取到了DNA

DNA的大小是否正确

今天我们学习的核酸琼脂糖凝胶电泳

就是实验室常用的一种能够对DNA

进行分离和鉴定的方法

本节课上我们会了解到琼脂糖凝胶

的性质 它是由什么组成的

他作为电泳的支持介质

具有怎样的优点

此外我们也会介绍

核酸琼脂糖

凝胶

电泳分离

DNA的原理

包括分子筛效应和电荷效应

以及DNA在电场中的迁移会

受到哪些因素的影响

我们先来回顾下什么是电泳

电泳是指在电场作用下

带电颗粒

像与其电性相反的电极移动

带电颗粒

因为分子大小构型以及所带电荷不同

因此在电场中具有不同的涌动速度

从而得到分离

电泳有不同的分类方法

根据分离原理可以分为区带电泳

移动界面电泳和稳态电泳

根据载体介质的不同

又可以分为醋酸纤维素薄膜电泳

聚丙烯酰凝胶电泳 琼脂糖凝胶

电泳等

琼脂糖凝胶电泳就是我们

这节课学习的内容了

它是以琼脂糖为支持物进行的电泳

是实验室常用的分离

鉴定量化和纯化核酸的实验技术

琼脂糖是从天然红色墨角藻

中提取的一种胶状多聚糖

它是由重复的异二糖 即琼脂二糖

以α-1,3糖苷键连接而成的中性

物质

琼脂二糖是由D-半乳糖

及其衍生物3 6-酐

-α-L-半乳糖

通过β-1,4糖苷键结合而成

由于琼脂糖凝胶具有无毒透明

电泳图谱清晰

分辨率高等特点

使他成为了生命科学和相关领域

研究中重要的电泳支持介质

通过调整琼脂糖的浓度

可以控制凝胶的孔径

达到制备分子大小不同

的核酸片段的目的

此外

因为凝胶胶凝温度和熔点低凝胶

具有了热可逆性即加热

溶解

冷却

凝固的特点

我们将琼脂糖粉末加入

缓冲液加热并冷却后

就会形成凝胶基质

它的孔径直径从

50~200纳米不等

由凝胶浓度控制

温度高于90度时

琼脂糖就会融化变成无规卷曲

冷却后两个琼脂糖链形成

由氢键连接的螺旋纤维

进一步冷却至胶凝固点以下时

通常小于40度

就会有更多氢键连接

形成螺旋束网络

进而形成具有三维网格的凝胶

由于加热可破坏

维持网格结构的氢键

因此琼脂糖形成了凝胶具有热可逆性

通过溶解含有目的片段的凝胶

可以回收样品用于后续实验

琼脂糖凝胶电泳分离DNA的原理是

分子筛效应和电荷效应的双重作用

DNA骨架上的磷酸基团可以解离

在高于等电点的ph溶液中带负电荷

当受到电场作用时

核酸从负极向正极迁移

这是电荷效应

此外

因为琼脂糖凝胶具有网状结构

不同分子大小和构象的DNA

在凝胶中受到的阻力不同

小分子物质受到的阻力小

移动快 大分子物质在涌动

中受到的阻力大

移动慢

这是分子筛效应

因此在凝胶电泳中

带电颗粒的分离即与净电荷

的性质和数量有关

也与分子大小相关

这就大大提高了分辨能力

DNA在电场中移动的

速度用迁移率表示

DNA迁移率主要与分子

大小和分子构型有关

同时也与凝胶浓度等因素相关

首先我们来看DNA分子

大小与迁移率的关系

凝胶电泳中核酸的迁移距离通常

与其分子大小具有可预测的相关性

从而能够计算样品中核酸的大小

对于线性双链DNA片段来说

在一定范围内迁移距离与

分子量的对数成反比

分子越大则所受阻力越大

也就越难以在凝胶孔隙中移动

因而迁移的速度越慢

分子量相同的DNA迁移

率就会完全相同吗

这可不一定

有时分子量相同的DNA

迁移率也会有差别

这是因为他们的构型不同

相同分子量的线状DNA有切口的

开环DNA和超螺旋DNA在

琼脂糖凝胶中的移动速度是不同的

超螺旋DNA结构紧凑移动最快

带切口的DNA是一个松弛开放的构型

因而体积大在凝胶中迁移缓慢

线性定义的迁移速度则介于两者之间

琼脂糖网状结构的孔径

取决于它的浓度

DNA

电泳迁移率的对数与凝胶

浓度呈线性关系

对于一个给定大小的现状

DNA分子

迁移速度在不同浓度的琼脂

糖凝胶中各不相同

比如这张图片是在相同电泳条件下

同一种低分子量标准在1%

2%和3%的琼脂糖

凝胶中分离的结果

红色圆点标出的是

1KB的DNA片段

可以看出它在不同凝胶

中的迁移率是不同的

因此要有效分离大小

不同的DNA片段

需要选用适当浓度的琼脂糖凝胶

表中是分离不同长度的DNA片段

推荐的琼脂糖凝胶的浓度

通常来说DNA分子量越小

需要选择的胶浓度越高

分离小于0.5KB的定义片段

所需胶浓度是1.2%~1.5%

分离大于10KB的DNA分子所需

胶浓度为0.3%~0.7%

DNA片段大小介于两者之间

则所需胶浓度为0.8%~1%

需要注意的是

低浓度凝胶很脆弱

难以操作

而高浓度凝胶则比较

浑浊会干扰DNA片段的可视化分析

此外电源电压核酸嵌入染料以及离子

强度也会影响DNA的迁移率

在低电压时现状DNA片段的

迁移率与所加电压成正比

但是随着电压的增加

相对分子质量大的DNA片段

迁移率的增加是有差别的

相对分子质量与迁移率之间

可能偏离线性关系

因此为了有效分离DNA

片段电压不宜超过5伏每厘米

核酸染料也会影响DNA的迁移率

比如常用的荧光 染料

溴化乙啶会嵌入到DNA

链堆积的碱基对之间

使线状DNA迁移率降低15%左右

电泳过程中使用的电极缓冲

液的成分和离子强度

对DNA的迁移率也有影响

缺少离子时

例如误用蒸馏水配制凝胶

电流传导小

DNA几乎不移动

在高离子强度的缓冲液中

如误加了10×的电泳缓冲液

电导会很高

导致大量热量产生

严重时会引起凝胶熔化或DNA变性

琼脂糖凝胶电泳中常用的缓冲液

有TBE（Tris-硼酸）

和TAE（Tris-乙酸）

DNA电泳受到的影响因素可真是不少

同学们在实验过程中要注意

选择合适的琼脂糖浓度

染料电极缓冲液

设定合适的电压

这样才能得到一张漂亮的电泳图片