离子交换层析资料文件与下载

依赖于带电性质进行蛋白质分离纯化的常见方法有等电点沉淀、离子交换层析和电泳。等电点沉淀已经在前面的视频中进行了介绍，电泳技术将在以后电泳部分进行专门的讲解，这里我将介绍离子交换层析技术。

在介绍离子交换层析技术之前，首先介绍柱层析（column chromatography），它是分离纯化蛋白质的有效技术。

柱层析系统由固定相和流动相组成。习惯上，人们将层析柱中的固相支持介质-柱填料称为固定相，将穿过支持介质的流动溶液称为流动相。

层析法也称色谱法，混合物中各组分由于其物理化学性质存在差异，它们在两相中的分布程度不同，在柱中的移动速度就不同，研究人员可以分部收集不同组分，从而达到获得目标组分的目的。

研究人员常常运用离子交换层析、凝胶过滤层析、亲和层析、吸附层析和疏水层析等等技术。

这里我首先向同学们介绍离子交换层析技术。

层析柱中的离子交换剂上具有可解离的基团，解离后的带电基团能够与待分离的混合物中带有与之相反电荷的各蛋白组分相结合，结合能力与各蛋白组分所带电荷相关。研究人员将待分离混合物加入层析柱中，混合物与交换剂进行结合、之后经过洗脱液洗脱，分部收集等过程可获得各蛋白组分，从而达到分离纯化蛋白质的目的，这种方法就是离子交换层析技术。

常见的分离纯化蛋白质的离子交换剂包括阴离子和阳离子交换剂两大类。

常见的离子交换剂有弱阴离子交换剂、强阴离子交换剂、弱阳离子交换和强阳离子交换剂，

阴离子交换剂二乙基氨基乙基纤维素，简称DEAE纤维素和季胺树脂Q。在一定pH范围内，它们能够解离出带负电荷的离子，之后自身带有正电荷，可以与带负电荷的蛋白组分结合阳离子交换剂羧甲基纤维素，简称CM纤维素和磺酸树脂S，在特定pH范围，它们可以解离出正电荷，而自身带负电荷，因此，可以与带正电荷的蛋白质组分结合。

以羧甲基纤维素CM-纤维素为例，它能够解离出带正电荷的离子，之后自身带有负电荷，可以与带正电荷的蛋白组分结合。

由于DEAE-纤维素和CM-纤维素所带的功能基团分别能够在pH大于10时或者pH＜4时，才能发生解离，所以两者为被称为弱阴、阳离子交换剂；而Q和S在水溶液中几乎一直保持解离状态，所以被称为强的阴、阳离子交换剂。

例如，采用阳离子交换剂分离含有三种蛋白质的混合物。当混合物溶液pH值小于三种蛋白质的等电点，此时所有蛋白质带正电荷。

首先将混合物样品加入层析柱，由于层析柱填料是阳离子交换剂，解离后带负电，它可以和三种带正电荷的蛋白质都结合，但是依据蛋白质带电荷性质不同结合强弱不同。

红色表示的蛋白质带正电荷最少，蓝色表示的蛋白质带正电荷最多，紫色代表的蛋白质带电荷居中。

将样品加入到层析柱中，三种蛋白质由于带有正电荷，都能够与层析柱中的离子交换介质结合。先采用低盐浓度洗脱液进行洗脱，由于盐离子和蛋白质竞争性地结合离子交换剂，所以在洗脱过程中，与离子交换剂结合最松弛的蛋白组分——红色表示的蛋白组分被盐离子置换出来，先被洗脱下来；蛋白组分由于带电荷性质不同，导致其与离子交换剂结合能力不同，因而在洗脱时，它们在柱中的下移速度不同，因而渐渐分开，结合能力最强的蓝色蛋白组分走得最慢。最后通过增加盐的浓度可将与离子交换剂结合最强的蓝色蛋白质也洗脱下来。

考虑到蛋白质在不同pH值溶液中带电情况不同，可知不同pH条件下，混合物中各蛋白组分与离子交换剂结合紧密程度也不同。因此，也可以通过调节洗脱液的pH值对混合物进行洗脱，以期达到分离的目的。很多情况下，研究人员常同时考虑盐浓度和pH值，采用两者的不同组合进行洗脱，以期达到更好的分离效果。

通常情况下，蛋白质并不带有颜色，那人们是如何获知蛋白质从层析柱中流出与否呢？记得之前曾了解了蛋白质具有280nm紫外吸收特性吗？对了，可以利用紫外检测仪来检测蛋白质是否出现。当蛋白质出现时，在紫外检测仪上会出现洗脱峰。

纵坐标表示蛋白含量，横坐标表示洗脱体积。所谓的洗脱体积是指从洗脱开始，到某蛋白质出现达到浓度最高值时所使用的洗脱液的体积（V_e）。

离子交换层析在蛋白质分离纯化过程中，常常是在精细分离时使用。请看下面的案例。

这是鸡卵粘蛋白分离纯化过程中的一个步骤。该蛋白前期通过丙酮沉淀粗分离、再进行细分级分离时采用了离子交换层析技术，填料是阴离子交换纤维素DEAE。