第四讲 抗药性检测及监测在线视频

同学们 大家好

我是来自中国农业大学

植物保护学院的梁沛

大家好

今天我们来介绍一下

抗药性的检测以及监测

目前

影响杀虫药剂使用效果的最主要的因素

就是害虫抗药性的产生

准确快速的田间抗药性检测

可以为杀虫药剂的合理以及轮换使用

还有其他的一些抗性治理策略的

及时调整提供依据

有利于延缓抗药性的发展

提高农药的使用效率

从而减少农药的使用量

同时呢

抗性监测还可以用于评价

所实施的各项抗性治理措施的效果

首先我们来看一下抗药性的检测

抗药性检测

就是通过检测昆虫田间种群中

抗性个体或基因的频率

那么对杀虫药剂的抗性水平

明确昆虫对杀虫药剂的敏感性变化

抗性检测

是进行害虫抗药性治理的重要前提

昆虫抗药性的检测方法

目前主要有生物测定法

生物化学法和分子生物学法三大类

那么第一类我们首先看一下生物测定法

这类方法主要就是通过传统的生物测定

来评价某种杀虫药剂对田间的种群

和室内敏感种群的致死中浓度LC50

然后计算田间种群的LC50

和敏感种群LC50的比值

我们把这个比值称为抗性倍数

当然 这里面的LC50

也可以用LD50

LT50

等其他的毒力指标进行代替

根据所用的具体生物测定方法

计算出来的毒力指标也不一样

可以用LC50

LD50

或者LT50

为了避免一次测定的误差

最好生物测定多做几次

然后用多次得到的平均值来比较

根据抗性倍数的大小

就可以判断抗性的严重程度

我国现行的多种农业害虫的

抗药性监测技术规程里面

对抗药性水平的分级做了一个规定

把抗性倍数小于5的称为敏感

抗性倍数在5到10之间

称为低水平抗性

10到100之间称为中等水平抗性

抗性倍数大于100称为高水平抗性

在传统生物测定法的基础上

在上世纪六七十年代又发展出诊断剂量法

也称为区分剂量法

就是根据敏感基线

算出能够杀死敏感种群99%

或者99.9%的个体

所需要的药剂的量

这个量对敏感种群

它的致死率几乎是100％

但是不能够杀死抗性个体

所以在检测的时候

我们就用这个剂量

对田间种群进行处理

比如说处理200头或者300头

然后看它的存活率

因为在这种剂量下

杀死的都是敏感个体

存活下来的都是抗性个体

所以存活率

也就是说这个种群里面的

抗性个体所占的比例

如果校正存活率大于20%

就判定这个种群是一个抗性种群

当然存活率越高

也就说明抗性个体的比例越高

那么这个种群的抗性水平也就越高

因为诊断剂量法可以在早期

检测到田间种群抗性个体的频率

这个对提前制订预防性抗性的治理措施

具有一定的指导作用

第二类方法是生物化学法

生物化学法检测主要是

在前期研究

明确抗性产生的生化机制的基础上

通过检测AChE对抑制剂的敏感度变化

或者通过检测多功能氧化酶

羧酸酯酶

谷胱甘肽S-转移酶等

这些解毒酶活性的变化

来评价种群中抗性个体的频率

一般也是以室内敏感种群的

相应的酶活性为对照

如果田间种群的酶活性显著高于敏感种群

说明田间种群已经产生了抗药性

这个检测的话

可以比较种群的平均的酶活性

也可以测定单头昆虫的酶活性

然后统计活性高于敏感个体酶活性的个体数

就可以知道抗性个体所占的比例

第三类方法是抗性基因检测方法

昆虫对杀虫药剂的抗性只是一种表型

它的本质是由于遗传上的改变所致的

也就是杀虫药剂靶标基因的突变

解毒酶基因的复制

或者过量表达

或者基因突变所致

在研究明确害虫产生抗药性的

分子机制的基础上

可以直接检测种群中抗性基因的频率

在害虫种群还没有表现出抗性之前

掌握它抗性基因频率的变化趋势

制订预防性的抗性治理策略

随着分子生物学

尤其是高通量测序技术

以及各种组学技术的快速发展

国内外在昆虫抗药性的分子机理方面

取得了长足的进展

明确了绝大多数类型的

杀虫药剂的作用靶标

并且获得了编码这些靶标蛋白的基因

明确了在昆虫神经系统

中肠细胞膜

以及几丁质合成酶基因等15类基因中

共有100多个

与杀虫药剂抗性相关的突变位点

另外还鉴定了大量的

与杀虫药剂抗性相关的解毒酶基因

并且明确了这些基因参与抗性的机制

例如P450基因的过量表达

羧酸酯酶基因的扩增 突变

另外还有GSTs

还有谷胱甘肽流转移酶基因的扩增

以及过量表达等等

这些成果

使得对害虫的抗药性基因

进行检测成为可能

针对昆虫抗药性基因的检测

主要有两个方面

一个是针对基因上

与抗性相关的点突变进行检测

第二个是针对基因表达量的检测

针对抗性基因点突变的检测技术很多

主要有两类

一类是基于普通PCR的

针对单个基因点突变的检测方法

比如等位基因特异性扩增技术等等

另外还有近年来发展起来的

基于环介导等温扩增技术的快速检测

以及基于低密度基因芯片的

抗性基因检测技术等等

针对多基因 多突变位点的检测

还可以采用

基于高通量测序技术的抗性基因频率扩增子

高通量检测技术

可以通过一次制样

同时检测多达20-30个采样点

每个样点

几千头害虫的多个抗性基因的

不同基因频率的检测

实现抗性基因的高通量检测

对基因表达量的检测

目前主要是利用荧光定量PCR技术来进行

针对抗性基因的检测

最大的优势是可以快速确定

田间种群中的抗性基因频率

尤其是基因芯片的高通量测序技术的应用

在抗性基因频率极低的情况下

也可以检测得到

这样就能够使通过

监测田间种群中抗性基因频率的动态变化

来预测抗性发展趋势成为可能

真正的实现抗性监测的预警功能

在抗性导致防治失败之前

及时调整治理策略

做到预防性的抗性治理

总体来看

这三类抗性检测技术各有优缺点

生物测定法

一直是害虫抗药性检测的主要方法

操作简单

结果直观

能直接反映害虫抗性水平的高低

但是所用试虫的量比较大

影响因素也比较多

同样的一个方法不同的人操作

它的结果可能有差异

所以方法很难真正的标准化

另外呢

在抗性基因频率比较低的时候

也检测不出来

往往在田间防治失败以后

才能够检测到害虫种群的抗药性

所以不能起到抗性监测所应有的预警作用

与生物测定法相比

生物化学法能在一定程度上

实现抗性基因频率的早期快速检测

但多数情况下酶活性的改变

与抗性水平并没有一个线性的相关性

不是说酶水平越高

它的抗性水平也就越高

而且影响酶活性测定的因素也很多

所以检测的准确率会受到限制

所以在测定过程中得到的结果

只能作为一个定性判断的参考

分子生物学方法能够实现

抗性基因频率的准确检测

尤其是高通量检测技术

可以对田间极低的抗性基因频率进行检测

极大地提高对抗性发展的预警性

但抗性基因频率的高低

与害虫抗药性水平之间的相关性

也是不确定的

不能够根据抗性基因频率的高低

来判断抗药性水平的高低

因此

在实际应用中

应该发挥这三类方法各自的优势

相互补充

这样的话能够提高

田间种群抗药性水平的检测

这是关于抗药性检测的三大类技术

第二块我们简单介绍一下

田间种群的抗药性监测

所谓的抗药性监测的话

就是利用我们上面提到的这些

不同类型的检测技术

对同一个地区 不同年份的

抗药性水平进行持续的检测

或者说对不同区域

不同作物

不同种植制度下

不同年份的这种

害虫抗药性的频率进行连续的监测

这样的话多年积累的数据

可以为害虫抗药性的发展趋势

作出一个预测

根据检测的结果

合理的及时的调整杀虫药剂的种类

使用频率

以及其他的综合防治措施的记录

这样的话能够更好的

控制害虫抗药性的发生和发展

最终实现绿色防控

减少农药的用量