6.6 光源和滤波片、照明方式在线视频

大家好

上节课我们介绍了显微镜的成像核心的部件

也就是物镜和目镜

今天我们一起来学习一下显微镜的照明

照明的目的是根据样品的特点

去选择合适的方式

产生明暗对比或者是颜色对比

方便观察样品表面的细节

如果照明的方式选择不当

同样是无法得到清晰的像的

广义上来说呢

前面课上提到的明场

暗场

荧光

差分干涉

相衬

甚至是我们超分辨等成像的方式

都是通过不同的照明方式来实现的

不过狭义上我们把差分干涉

相衬和超分辨

这些方法归结为成像原理

本身有新的突破

而不仅仅是照明方法有所改良

所以在这节课上

我们只关注常规的明场

和荧光照明的原理和设计方法

并且简单地介绍一下暗场的实现方法

照明系统一般由光源

滤光片

照明光路这些部分组成

我们会从波长

相干性

均匀性

亮度

稳定性等方面来考察照明的性能

下面将逐一进行介绍

照明光的波长

或者说它的光谱分布

直观上来讲就是照明光的颜色

如果要是不考虑像相衬

差分干涉等等

这些对相干性有所要求的成像方式

常规明场几何成像

一般会要求光源在整个可见光区

都具有宽阔而比较平坦的光谱分布

这样对于不同颜色不同吸收率的样品

都能够有良好的照明效果

照明的光谱直接就由光源所决定了

如果我们配合上滤光片

能够对光谱进行筛选

但是却没有办法超出光源的光谱范围

我们来看一下

这一张是显微镜常用的光源的光谱分布图

最常用而且成本较低的照明光源是卤钨灯

简单地来说就是填充了卤族气体

用于延长灯丝寿命的白炽灯

大家看到这一条是卤钨灯的谱线

由于这一类光源都是热致发光

它的优点是从红外一直到紫外

光谱非常的连续而且平坦

是非常良好的白光光源

由于它在长波部分

也就是偏红外部分能量会更高一些

所以相对来说它的色温比较低

眼睛看上去的感觉

会觉得这样的光源发出来的光偏黄

不过卤钨灯与所有白炽灯一样

它的缺点就是发热量极大

接下来我们看到这两条光谱

在紫外和可见光区都有非常明显的峰

而且这两条光谱线位置的重合度较高

它们对应的分别是

水银弧光灯和金属卤化物的光源

这两种光源经常用于荧光显微镜中

用于激发荧光

最下面这条最平坦的光谱是氙灯的光谱

氙灯也是一种白光的光源

而且它的光谱分布与日光非常的接近

因此它的照明效果与自然光是最接近的

它的色温会比卤钨灯要高一些

目视会感觉颜色偏白

除了上述经典的几种光源以外

近年来随着光伏产业的发展

LED照明逐渐也进入了传统的照明领域

LED这三个字母

是发光二极管的英文缩写

这种光源具有体积小巧

能耗低

坚固耐用

寿命长

热量少

环境污染少

成本低

易集成等等诸多的优点

这也是为什么

我们在日常生活中就能够感觉到

照明的光源很快地就从原来的白炽灯

变成了节能灯

然后现在进一步地变成了LED

最初的LED光源呢

只有红色和绿色等等

非常有限的颜色

之后在蓝色

白色LED成功被研制之后

在许多专业的领域

LED照明几乎已经取代了传统的光源

这一张是几种LED的光谱分布

我们看到它的峰值从红色

到紫色 到紫外都有

与前面给出来的光源光谱不一样的是

LED发出来的光不是连续谱

而是一个非常窄的带状谱

因此如果要产生白光照明的效果的话

需要根据色度学的原理

选择黄色加蓝色

或者是红色 绿色 蓝色

三原色组合的这样一种合成照明的方式

所以在LED的灯箱中

一般都不止使用一颗LED灯

而会排布有几种不同颜色的灯

然后利用不同的光学系统

对这些光进行合光以后

从光纤或者是自由光学元件

比如说反射镜出射进行照明

这幅图中给出来了一个LED的灯箱

我们看到它使用了红

绿

蓝

黄

紫等等颜色的LED

然后利用半透半反镜进行合光

之后通过整形透镜

来调整整个光束的形状

最后通过光纤出射灯箱

现代的显微镜已经是模块化

标准化的仪器了

因此光源的部分也制定了一定的

结构尺寸规格和电气连接规格

这样方便不同的光源之间进行更换

这个是蔡司公司出品的卤钨灯

LED灯

氙灯和金属卤化物灯箱的外形图

在光源的种类确定之后

根据不同的发光原理

它的亮度和稳定度也基本确定了

显微镜在绝大多数情况下

都是用于定性的观测的

因此对光强稳定性的要求不是特别高

上述提到的光源

都是经过多年的仪器研制和实际使用

保留下来的经典的光源

它的亮度和稳定性

都适用于绝大多数的观测需求

不过

上述卤钨灯

氙灯

LED等都是非相干的光源

只适用于做常规的几何成像

如果需要应用相衬

或者是微分干涉等等原理

产生特殊的成像效果的话

那么对光源的相干性要提出一定的要求

相信对于学过物理光学的观众来说

相干性这个概念并不陌生

它指的是光束能够产生

稳定的干涉条纹的性质

相干性可以分为时间相干性和空间相干性

前者对光源的谱线宽度有要求

谱线越窄 时间相干性越好

后者对光源的形状有要求

当然了

相干性最好的光源是激光

如果想用常规的光源

又要产生相干光的话

那么可以通过这样的光路来实现

首先让非相干的光源

比如说弧光灯发出非相干光

通过一个针孔光阑

就能够产生空间相干性良好的光

然后再通过一个窄带滤光片

限制其透过的波长

就能够得到时间相干性良好的光

这种能产生时间相干光的

窄带滤波片又叫作干涉滤波片

它是一种利用多层介质膜

透反射光分别进行干涉相长

和干涉相消原理所制成的滤光片

一般一块干涉滤波片

只有一个透过的中心波长

而且带宽在10个纳米以内

除了干涉滤光片

在显微镜中还有一类重要的滤光片

那就是二向色滤光片

这是一幅典型的

二向色滤光片的光谱透过率曲线

我们可以看到

这种滤光片其实是一个高通的滤波器

当光波长低于截止波长的时候

它的透过率是很低的

当光波长高于截止波长时

透过率非常的高 接近1

那么这种滤光片有什么用呢

大家注意看一下

这里除了画出了滤光片本身的透过率曲线

还画出了一个激发光

和一个样品发射光的谱线

对的

通过前面的介绍我们可以知道

在荧光显微镜中

激发光是进行落射照明的

也就是它要共用

物镜的光路同时进行照明

还要接收信号光

如果激发光和样品发射光同时进入了探测器

而探测器对两者都有响应的话

那这个时候激发光就会成为背景噪声

从而极大地降低图像的对比度

我们使用这种二向色滤光片

就能够把激发光挡在探测系统之外

从而保证样品发射光

以极低的损耗进入到探测系统中

在解决了波长

相干性

亮度和稳定性方面的需求之后

我们来看看如何能够实现均匀的照明

显微镜常用的照明方式

包括柯勒照明

临界照明等

这些也是投影仪等等

光学仪器中常用的照明方式

下面我们以柯勒照明为例

介绍光学系统中的一些共轭面

这里需要观众对于成像共轭的概念

以及光学系统的光瞳面的概念

有一定了解

所谓柯勒照明 它的基本思路

就是把光源成像在物镜的入瞳上

以获得在样品表面尽可能大面的均匀照明

如这幅图所示

我们来看一下这两组共轭面的示意图

左侧这一组是共轭的视场面

也就是所有与样品共轭的面

或者说与样品满足成像关系的面

从照明系统一直到人眼

分别是照明聚光镜的视场光阑

样品的物面

中间像面以及人眼的视网膜

这一组面描述的

是显微镜中的成像关系

也是大家非常熟悉的

右侧的这一组是共轭的孔径面

也就是描述的与光源共轭的那一些面

如果从照明系统一直到人眼的话

分别应该是光源本身

聚光镜的前焦面

物镜的后焦面

以及人眼的瞳孔

这一组面描述的是照明关系

可能相对来说大家不是那么的熟悉

不过我们注意看一下样品前后

通过这样的一组设置

在照明光通过样品的时候

几乎是以平行光通过的

这样就能够极高地提高

在样品上照明的一个均匀性

那么最后我们再来看一下

所谓的暗场照明是怎么实现的

暗场本身的要求是

照明光不能够进入到物镜

这样我们观察到的

才是样品散射或者衍射所成的像

在前面讲解了物镜的数值孔径的定义之后

我们就知道

这样就意味着照明光本身的数值孔径

必须要大于物镜的一个数值孔径

因此我们首先需要一个

数值孔径大于物镜的照明聚光镜

之后在照明聚光镜上设置一个暗场的光阑

产生环形的照明

把物镜数值孔径内的照明光

给遮挡住

而让数值孔径外的照明光能够顺利地通过

这样就能够形成暗场的照明

不过

由于设计大数值孔径的照明聚光镜

同样也是一件很困难的事情

如果在物镜本身的数值孔径

特别大的情况下

用常规的单透镜或者多透镜的方案

可能没有办法解决这个问题

此时可以采用

如图中所示这两种特殊的

抛物面形的反射聚光

或者是心脏形的反射聚光镜

这样的方案

来直接产生环形的照明光

实现暗场的成像

到此我们已经讲解完了

显微镜的基本的原理和组成

在这儿我们对显微镜基本的工作原理

和设计方法做一个小结

第一

无论在传统的光学显微镜

还是现代的光电显微镜中

照明系统

物镜

和目镜都组成了基本的成像光学系统

也是显微镜的核心的部分

它的设计实现除了涉及到光学设计

还需要光学制造

机械设计和装调

等等多方面的知识和技能

也需要大量的经验

第二

现代显微镜的光源

物镜和目镜等等组件都是采用模块化的设计

具有一定的行业标准和国家标准

这些使得显微镜的选购

使用和改造都变得更加的容易

那么在后面的课程中

我们将展示显微镜的使用方法

以及两种较新的显微技术

最后我们将会给出一些业内的访谈