6.9 相衬显微成像技术在线视频

大家好

这节课我们来介绍一下

Zerinike获得1953年诺贝尔奖的发明

相衬显微镜

在前面的典型显微图像部分

我们曾经介绍过

相衬显微镜是适用于本身是完全透明的

但是具有一定的厚度

或者是折射率分布的样品

这里的折射率分布

有可能是由于样品内部不同的成分

或者不同的结构 不同浓度

所造成的折射率的不均匀

在相衬显微镜发明之前

人们用明场显微镜

去观察这些样品的时候

只能够看到非常模糊的边界

内部的细节非常非常的不清楚

就像左边这幅图这个样子

如果我们使用相衬显微镜

就能够让样品内部的细节

也变得非常明显

就变成了右边这样

为了解释一下相衬的原理

我们首先来看一下

当一束光通过样品的时候

到底发生了什么

学过大学物理

或者是物理光学的同学们知道

光是一种横波

如果我们将情况简化

只考虑一种特定的波长

传播的方向也是单一的光的话

那就是所谓的单色的平面波

我们就可以用这样的一条正弦曲线

来表示光波的传播

如果这么一束光通过一般的物体

也就是我们用明场显微镜能够看到

明暗分布的物体的话

我们把这样的物体称作振幅的物体

那就表示

这根线会发生一定的变化

那到底是什么变了呢

是振幅变小了

表示光的能量变小了

因为这些能量被样品给吸收了

就变成了像第二根线这样

能量被吸收的部分看起来就会变暗

吸收得越多就会越暗

这样我们就能够看到样品的细节了

但是完全透明的样品

基本上是不吸收光的

振幅不会变

那怎么办呢

不怕 我们知道光作为一种振动

除了有振幅还会有相位

这些透明的样品

虽然不会改变照明光的振幅

却会改变相位

产生相位的延迟

就像我们看到的第三根线这样

这个相位延迟的大小

与样品厚度的分布

折射率的分布都有定量的关系

就像这个示意图里画出来的

比如说当光通过细胞里面

比较薄的部分的时候

发生的相位延迟就比较小

通过细胞里比较厚的地方的时候

相位延迟就比较大

这样

完全透明的样品对光还是有一定影响的

或者说有一定调制作用的

下一步就应该考虑

怎样才能让我们看到这个相位的变化了

我们都知道

人眼是没有办法

直接看到光波的相位的变化的

最常用的将相位转化为振幅

或者是能量变化的方法就是干涉

我们在干涉仪这一章

有过非常详细的讲解

不过 在观测用的显微镜光路中

如果要再设置一路参考光

来与通过样品的信号光发生干涉

是比较麻烦的事情

那么我们的泽尼克

他发明相衬显微镜的伟大之处

就是用相对比较简单的装置

只需要改造一下照明的聚光镜和物镜

就可以把样品的相位分布

转化为振幅的分布了

所以接下来我们先看一下

泽尼克设计的相衬显微镜的结构和光路

大家看这幅图

左侧没有画出来的地方有光源

光源通过聚光镜照明了样品

然后通过物镜成像在中间像面上

与之前介绍过的明场显微镜不一样的是

我们注意到在聚光镜的前焦平面上

增加了一个环形的光阑

在物镜的后焦面上

也增加了一个环形的

是个什么东西呢

是个相位板

这个环形的光阑

会使得样品上的照明光发生一定的倾斜

而且这一束倾斜光是平行的

它直接穿透样品以后

这样形成的信号光是零级的透射光

它携带有样品的相位分布

继续传播 经过物镜偏转以后

通过了环形的相位板的环形部分

环形部分镀有一定厚度的薄膜

这一层膜有两个作用

其一是衰减零级透射光的振幅

其二是让零级透射光产生π/2的相移

为什么要人为地去改变零级透射光的

振幅和相位

我们在这儿先卖个关子

大家注意到

如果只有这个零级的透射光

那我们还是没有办法

看见样品的相位分布

于是 大家注意

图中除了有零级透射光之外

还有一些从样品

发散开的这片红色的光

这一部分的光是散射

或者是高级次的衍射光

它的强度是很低的

不遵循直线传播的规律

但是也会携带有样品的相位分布

因为传播的方向各异

所以大部分的高次衍射光

是不会通过相位板上的环形部分的

因此它的相位分布不变

在这之后

在中间像面上

我们的零级透射光

和高级衍射光就相遇了

它们会演绎怎样的故事呢

这个故事有不同的讲法

因为我个人更加喜欢公式版本的故事

所以 以下用公式来解释一下

相位是如何转化为强度的

这样一个物理过程

这一部分对没有学过物理光学

或者大学物理光学部分的同学来说

会比较难

那么这部分同学可以只听推导的思路

我们知道零级透射光是一个单色平面波

那么它的复振幅分布会满足这个公式

这是一个最简洁的单色平面波的公式

式中A1是实振幅

考虑到我们的样品几乎是完全透明的

而且我们的照明光也是均匀的

所以此处A1是一个常数

A1后面的指数项是透过率函数

它与相位分布是有关系的

如果将这个指数项进行级数展开

可以得到下面这个式子

这里为了简洁

我们省略了公式

右侧所有的空间分布项(x,y)

在展开式里 括号里的第一项

就是零级透射光

这部分光沿直线传播

后面的部分是高次的衍射频谱项

由于环形相位板的作用有两个

如果大家还记得

第一是衰减零级透射光

第二是使其发生

δ=π/2的相移

因此 经过物镜成像和环形的相位板之后

在像平面上复振幅分布

就会变成这个公式这样

我们注意到空间的坐标

从物面的(x,y)变到了像面的(x′,y′)

并且括号里的第一项发生了变化

a是零级透射光复振幅衰减的系数

对这个展开式我们做一个简单的添项

如果给后面的高次项添加一个1

然后再把这个1减掉

我们就能再凑成一个

级数展开之前的透过率函数了

像这个公式这样

接下来我们就来求取像面上的光强分布

用复振幅乘以它的复共轭再化简

就得到这样的式子

也就是像面的光强分布

它跟相移δ=π/2

以及样品的相位分布φ

都是有关系的

这个式子比较复杂 我们继续往下化简

把δ=π/2代入

并且考虑到

我们观察的样品都是非常薄的

一般不会超过5个微米

那么它的相位变化φ是很小的

所以由小角度近似

能够得到这个公式

我们看到这就非常的简洁了

像面的光强分布

直接与样品的相位分布成正比

当相位越大的时候

这一点就会越亮

称之为正相衬

这个时候使用的相位板的结构示意图

是这样的

它对应的成像的示意图如下面这幅所示

如果我们把最初

环状相位板引入的相位分布

相位变化设为3π/2

或者是-π/2的话

那么光强的分布就会满足这个式子

在这种情况下

相位越大的情况下这一点反而会越暗

我们称之为负相衬

对应的相位板的结构示意图是这样的

成像的示意图是这样

另一方面我们注意到2φ

也就是样品的相位分布引起的光强变化

是要叠加在a的背景之上的

所以如果a本身很大 接近1

也就是相位环它的衰减作用非常的小

而我们知道φ又是远小于1的

那φ引起的那一丁点的光强变化

就看不出来了

所以为了让φ变得明显

a也是要经过精心设计的

最后我们再看一下相衬显微镜的光路

为了提高相衬图的对比度

还有下面几件事情是可以仔细考虑的

第一是聚光镜的环形光阑

与环形相位板的尺寸

相对位置是需要仔细的设计和装调的

这样才能够使得零级透射光

全部都通过环形相位板

第二是系统的照明光源

它的相干性应该尽量的好

到这儿我们就讲解完了

相衬显微镜的工作原理

这个原理中包含了

几何光学和物理光学的知识

难度是比较高的

因此它是一种在原理技术上

综合性比较强

而在应用方面

解决了之前瓶颈问题的

这样的一种显微镜技术

不过在获得诺奖肯定以前

泽尼克的相衬显微镜推广之路并不平坦

早在1932年

泽尔尼克就已经试制成功了

第一台相衬显微镜

同年的4月26号

他就向德国申请了专利

不过一直经过他不断的努力

到了1936年

德国专利局才批准他4年前的申请

而从1933年开始

泽尼克就拿着他的专利

向一些学术会议 相关的公司

去论证他的相衬显微镜的作用

并且想拉一些赞助来发展生产

可惜那个时候都没有得到重视

在那之后又受到了第二次世界大战的打击

一直到1941年

蔡司公司才开始生产相衬的物镜和附件

这个期间间隔了将近10年的时间

而现在 相衬显微镜已经广泛地应用于

生物学以及医学方面

作细菌学和病理学的研究

也在矿物晶体的微形貌学中

得到了有效的应用

那么这是某款相衬显微镜

目镜和配件的实物图

它已经作为显微镜的标准配件

在市场上销售了

通过泽尼克和相衬显微镜的故事

希望大家能够了解到

这种新型的显微观测手段的特点

掌握它的基本原理

同时也能够从泽尼克的经历中

汲取一些动力

投身于我们光电仪器事业

那么显微镜部分的技术内容讲解

到此就全部结束了

在后面的部分

我们将采访两位业内人士

听听他们对显微镜技术发展的见解

欢迎大家继续关注