2.1 PCR基本原理在线视频

我是来自于北京化工大学

生命科学与技术学院的罗施中

今天我跟大家分享的题目是

聚合酶链式反应

也就是PCR

Polymerase Chain Reaction

那么聚合酶链式反应

它最主要的作用是干什么呢

它主要是进行一个体外的扩增的反应

那么我们用聚合酶链式反应

最主要的作用是干什么呢

我们主要是

如何能够从大量的基因组里面

来研究我们所感兴趣的

单一的其中的一个基因

那么我们解决的方法又是什么呢

主要就是刚才所说的聚合酶链式反应

那么通过聚合酶链式反应

能够让我们快速的

对我们所感兴趣的专一的DNA片段

进行一个扩增的过程

那么这个PCR

也就是聚合酶链式反应

它首先是由上世纪80年代

由穆里斯以及相关的工作人员

首先发现的

那么自从首先发现了PCR的过程之后

到现在来说

已经有成千上百种的相关的研究

已经用PCR实现了它的过程

那么正是由于穆里斯

在链式聚合酶反应中间

所取得的突出贡献

1993年穆里斯获得了

诺贝尔化学奖

由于他在链式聚合酶反应中间的

突出贡献

那么聚合酶链式反应

它所依赖的原理是什么呢

它主要是依赖于沃森克里克的

这种双螺旋的AT配对

以及GC配对的原理

它主要是通过AT所形成的两对氢键

以及GC所形成的三对氢键

从而利用DNA的

它的这种变性复性的相关的原理

来实现它的一个体外扩增

那么PCR它主要实际上是

它依赖于我们所选择的模板

通过把我们的模板

从单一的一条DNA链变成双链的过程

那么在从DNA变成双链的过程中

它必须需要一个非常重要的

一个蛋白质的一个组分

也就是依赖于引物的DNA聚合酶

那么这个DNA聚合酶

就是我们在这个PPT上所显示的

它看起来像一个手掌的形式

它通过手掌的形式

能够抓住我们的DNA的双链

然后把DNA它的一个扩增

从5’端到3’端

实现它一个扩增的一个过程

那么在进行体外的PCR过程中间

它所需要的原料是什么呢

那么首要的

当然也就是我们所需要扩增的模板

也就是我们目标的这个基因

第二个我们得到了我们模板之后

我们必须要选择

我们所需要扩增的引物

来提供它的一个选择性

然后我们必须需要我们的

在进行扩增过程中间所需要的原料

也就是dNTP

那么我们具备了模板 引物 原料之后

那么当然我们最需要的

也就是刚才所说的DNA聚合酶

然后在我们合适的

缓冲溶液buffer中间

能实现我们一个体外的

PCR扩增的过程

那么这个PCR它到底是

怎么来实现它的扩增过程呢

这实际上就是它一个所谓的

一个循环的过程

那么在这个循环的过程中间

首先第一步

也就是我们的模板实现它的一个变性

第一步是一个变性的过程

从双链变成单链的过程

第二个是我们所需要的一个

所谓的一个退火的一个过程

那么退火的意义是什么呢

它主要是使我们的引物和我们的模板

能够很好的粘合在一起

第三步也就是一个扩增的过程

也就是或者是延伸的过程

那么这个延伸的过程

也就是当引物和模板结合在一起之后

在DNA聚合酶的作用下

实现它的一个扩增过程

那么这一个循环

实际上在进行体外扩增的时候

它这个循环会逐渐的一个循环的

发生一个循环的过程

循环到最后来得到我们所感兴趣的

一个基因的一个片段

也就是如果我们对我们的PCR过程

进行一个数学方程式的一个表达的话

我们可以看到

它实际上是我们最终得到的一个产物

它实际上是等于

我们扩增的次数的指数方

然后乘上我们初始的一个模板

也就是P = Y的n次方乘上X

其中Y就是我们所说的倍增的指数

一般来说理想状态下就是一个2

那么X也就是我们所用的

初始的一个原料的浓度

那么如果说我们把PCR过程

作为一个理想的状态的话

那么实际上如果我们进行一个

20倍的PCR的扩增的话

那么实际上这个最终的产物

实际上p就得会等于2的20次方

那么乘上我们原来的

初始的原料的浓度

那么最终大家可以看到

如果对于我们的一个模板

进行一个20次的扩增

最终通过20次扩增之后

我们可以得到大约能够

理想状态下能够得到它

扩大到100万倍的

这么一个扩大倍数

那么在PCR的发展的历程中间

实际上最关键的一个步骤

也就是说DNA聚合酶的选择

因为大家都知道

在正常的生物体内DNA的聚合酶

最适的反应温度

一般来说都是大约是37度

但是我们在进行PCR的过程中间

实际上是我们需要

通过一个高温的一个变性的过程

那么在这个高温变性的过程中间

实际上DNA聚合酶

可能它会发生一个变性的反应

那么这样的话大部分的DNA聚合酶

会导致它失去它的一个活性

所以这也就导致了

PCR体外反应的失败

那么在PCR的发展历程中

实际上最后终于找到一个

最佳的一个DNA聚合酶

也就是从温泉里面得到的嗜热菌的

这么一个DNA聚合酶

那么这种DNA聚合酶

它实际上能够在高温下非常的稳定

这样的话能够保证它在PCR过程中间

在变性的时候

它整个的DNA聚合酶不会失活

那么这实际上就是一个

我们简单的一个PCR的一个仪器

它包括包含了三个最主要的步骤

第一个实际上是它所谓的

这种起始的一个步骤

那么在起始的步骤中间

包括一个整个的一个DNA的

一个变性的一个过程

然后第二个步骤是一个整个大约是

如果我们要进行一个30次的循环

那么这就包括了刚才所说的

变性 退火 延伸这三个步骤

进行的大约30次的一个循环的过程

那么最后一个步骤

也就是说在完成它整个循环步骤之后

最后我们可能需要进行一个

扩大时间的一个延伸

然后得到我们所需要的目的的片段

那么对于一个基础的PCR反应

实际上我们需要我们所说的

第一个我们需要的反应buffer

然后需要我们所选择的这个引物

包括前引物和后引物

以及dNTP和目标的DNA片段

和最终我们需要加我们的DNA聚合酶

最终使我们得到一个基础的

一个PCR的一个反应

那么在这个基础的PCR反应中间

我们可以看到实际上对于市面上

大家可以非常容易得到的一个试剂

PCR反应的试剂盒

它会提供一个10x的

一个PCR的一个反应缓冲溶液

那么这张PPT显示的

实际上就是一个最为基础的

一个PCR反应的反应液

那么我们可以看到

实际上对于一个100微升的

一个反应液中间

我们所要加的

第一个是10x的反应buffer

第二个是dNTP

使我们最终的反应的浓度

能够达到大约是100个微摩

然后前引物和后引物

那么在反应中它的浓度

大约是20个微摩尔左右

那么我们的目标的DNA的选择

一般来说大约是

10个纳克到2个微克之间

那么同时我们也需要选择

我们所需要的DNA聚合酶

那么最终大约是一个100微升的

这么一个反应的体系

那么在这个10x的buffer里面

对于公司所提供的这种试剂盒来说

一般来说大约所包含的大约是

500毫摩的氯化钾

以及tris盐酸盐

那么最终实际上我们还要加入

0.1%的这种明胶

来帮助我们溶解整个的这个反应液

那么在我们在进行反应的时候

我们所需要考虑的相关的

一些非常重要的一些部分的话

那我们首先来看一下

第一个我们需要考虑的

实际上是我们的目标DNA

那么大家都知道

我们得到的这个模板也是目标DNA

它首先我们必须要保证

它是一个非常干净的一个DNA

也就是说它不能够有其他的

比如说蛋白质 盐

或者是有机溶剂苯酚等它的一个污染

因为大家都知道

我们如果来提取一个DNA的话

它需要把DNA

从我们所说的这种细胞的裂解液里面

来提取得到我们DNA

那么一般来说

可能会导致一些蛋白的污染

所以说我们对我们的这个模板

尽量的使它的浓度能够比较高

同时其他的污染尽量的少

第二个我们在选择dNTP的时候

一般来说我们都选择的

大的反应的pH值尽量是7.0

同时我们必须要保证我们的所选择的

比如说其他的

这种dNTP所能够的浓度

必须是均一的

能保证它不会导致其他的一些

过多的这种missmatch的产生

同时大家可以看到

我们在选择引物的时候

一般来说我们必须要加入过量的引物

大约为最终的引物的浓度

能达到一个微摩

从而使我们的退火的反应

能够朝我们所需要进行的方向进行

第三个我们在考虑

这个引物的浓度的同时

我们也必须要考虑到

其中所包含的这种镁离子的浓度

同时我们反应的体系一般来说

根据我们的需要

从25微升到100微升的话

都是可以的

那么在选择的buffer的同时

大家可以看到

我们可以选择不同的这种buffer

那么包括不同的盐

同时我们也需要选择一些

助溶的一些溶剂

来帮助提高聚合酶的稳定性

和它的退火的效率

那么在这种助溶剂的选择中间

一般我们可以选择所谓的明胶

或者是甘油 或者是DMSO

都能够提高我们反应的反应效率

我们在进行PCR反应的过程中间

如果PCR的反应时间过长的话

那么可能会导致溶液的蒸发

所以说我们有可能会在PCR的

这个溶液的上层会加入一个保护层

那么这种保护层

我们可能可以选择一些矿物油

或者是封口膜

那么减少我们在进行这种变性反应

加热过程中间的蒸发

溶剂的蒸发过程

所以这实际上是

我们在做PCR反应中间

我们都需要进行考虑的一些部分

那么在进行一个PCR反应的时候

大家可以看到

这实际上是我们所体现的一个

整个的循环的这么一个循环参数

那么在第一个循环的时候

大家可以看到

我们可以选择对这个反应

进行94摄氏度的5分钟的

一个变性的过程

然后后续我们再进行

退火和延伸的过程

对于整个的这个循环实际上可以看到

在进行Denaturation的时候

我们为什么要选择5分钟呢

那么主要是第一个反应

第一个循环的时候

我们使它保持一个足够长的时间

然后来使我们整个的模板进行一个

就是说所谓变性的一个过程

那么在进行变性的时候

我们一般来说选择大约是94度

进行一个变性的过程

那么在进行第一个反应的时候

我们一般来说可能要

反应一个比较长的时间

能够使我们的模板

进行一个完全的一个变性的过程

那么接下来在进行退火的时候

那么退火温度的选择主要是依赖于

我们的引物的变性温度

然后在最后一个步骤进行延伸的时候

实际上一般来说多选择72度

因为72度实际上

对于我们大部分的DNA聚合酶来说

是一个最适的一个反应温度

那么这个延伸的延伸时间

它主要是依赖于

我们的所需要进行扩增片段的长度

以及DNA聚合酶

它的一个反应的速度而决定的

那么对于这个扩增的次数

主要是依赖于我们所需要进行

PCR的时候所需要进行的应用

那么它如果是超过四十次

或者是以上的话

就会导致它会DNA聚合酶的

一个失活的过程

所以说一般来说最适的一个

最适的一个循环的次数

大约是30次左右

那么接下来我们会给大家介绍

一个最为重要的一个方面

也就是说我们在进行PCR的时候

我们怎么来设计我们所需要的

这么一个引物的过程

那么对于一个PCR的反应

引物的选择至关重要

首先我们要选择一个

非常好的一个目标的一个序列

一般来说

对于一个最基础的一个PCR反应

大约是100到500个bp

但是同时

如果我们进行整个基因的扩增的话

实际上我们也可以长度达到一个

10个kb的这么一个长度

而我们在进行扩增的时候

我们选择的

所谓的前引物和后引物的选择

一般来说它的长度

大约是18到25个碱基之间

同时我们一般来说

选择的这个引物的它的一个变性温度

也就是Tm值

一般来说大约是在52到80度之间

同时我们在设计引物的时候

一般的它的GC含量

不要过多或者是过少

尽量使它在50%左右

同时我们一般在进行

这个PCR的设计的时候

我们希望引物的3’端

尽量是GC rich的片段

那么这样的话有助于

我们在进行 PCR的反应过程中间

尽量会导致它的所谓的这种

这种配对的失败的这种现象

所以我们一般来说

尽量的是3’端的引物

尽量是GC rich的过程

同时我们也尽量不要

使我们设计的引物

不要以A或者是T开头

因为大家都知道A和T的配对

一般来说都只有两对氢键

所以说它们是

相对而言是不是很稳定的

同时我们在设计引物的时候

我们一定要注意

保证我们的引物不会形成分子内

或者是分子间的这种发卡的结构

因为它如果形成了分子内

或者分子间的发卡结构

就会导致我们的这种引物

和这个模板之间的配对产生一些误差

最后我们在设计引物的时候

我们尽量不要

使我们的碱基受到任何的

在合成的过程中

不要受到任何的损伤的过程

那么我们在设计我们的引物

就是说选择好我们的引物之后

那么我们要做一个非常重要的一个步骤

也就是说对它的Tm值

变性温度进行一个计算的一个过程

那么Tm值根据我们的经验公式

实际上Tm值它可以得到的

一个经验公式大概是

Tm=81.5+16.6(logM)

其中这个M

就是我们所选择的这个盐的浓度

加上0.41乘上GC含量的百分比

同时要减去500/n

那么这个n它主要是指的

实际上就是我们的引物的长度

在我们得到这个经验公式之后

我们举一个例子

比如说我们所选择的这个盐

或者是buffer缓冲溶液的浓度

大约是0.05个M的氯化钾

加上0.01个M的Tris盐酸盐

那么它最终的缓冲溶液的浓度

大约是0.06个M

因此我们如果选择的引物大约是一个

大概是18个碱基的一个引物

它的GC含量大约是50%

那么通过我们的这个经验公式

我们来看一下

它最终得到的Tm值大概是多少呢

实际上这就是一个Tm值的

一个计算的一个方式

那么最终实际上我们可以看到

通过这个经验公式的计算

Tm值大约是54.3度

那么我们在进行选择退火温度的时候

一般来说我们要选择

退火的温度要比所计算的这个Tm值

大约要低2到4摄氏度左右

因此如果对于这一个引物来说

我们大概选择的退火温度

大概是50度左右

那么我们在选择好引物之后

那么接下来我们要选择

我们的DNA聚合酶

那么我们以前的

这个分子生物学的讲解中间

我们都知道DNA聚合酶

它具有非常多的不同的

所谓的外切酶的一些活性

那么首先我们来看

第一个我们选择DNA聚合酶

必须要有一个高温的稳定性

也就是说我们的这个DNA聚合酶

要能够在进行PCR反应的时候

要必须非常的稳定

第二个 有一些DNA聚合酶

它实际上是有5’端到3’端

外切酶的活性

那么这些DNA聚合酶它一般来说

它既然具有5’端到3’端

外切酶的活性

它主要会用在

比如说像我们后面会跟大家介绍的

实时荧光定量PCR过程中间

那么在进行探针的切除的过程中

会利用到5’端到3’端

外切酶的活性

同时一部分DNA聚合酶

它有3’端到5’端的外切酶的活性

那么关于具有3’端到5’端

外侧酶活性的DNA聚合酶

它主要提供的作用实际上是

提供它的一个所谓的自我修复的能力

也就是说这部分的DNA聚合酶

它是具有一些高保真的这种活性

也就是说它在DNA扩增过程中

它的出错率是非常非常低的

因此一般来说

具有3’端到5’端外切酶活性的

DNA聚合酶

它主要应用于基因的扩容等等

大片段的这种PCR的扩增

同时一部分的DNA聚合酶

它在进行DNA的扩增过程中

它可能会导致一些

DNA的所谓的这种片段的这种

或者是在DNA会加入一些

游离的A的一个过程

那么这些实际上在我们后续的一些

像TA克隆这里面可能会应用到

这一部分的DNA聚合酶

如图所示

这是我们最为常用的一些DNA聚合酶

那么相应的DNA聚合酶

它具有不同的稳定性

那么像其中的DeepVent

它具有最高的稳定性 热稳定性

那么同时其他的像Taq酶

以及Tth酶等等

它都具有的5’端到3’端

外切酶的活性

而其他的像Vent DeepVent

以及Pfu等等

它具有3’端到5’端外切酶的活性

同时在这些酶里面

其中只有Tth酶

它具有了这种反转录酶的活性

那么在进行PCR反应过程中间

同时我们还需要考虑镁离子的浓度

那么过高的镁离子

它会导致我们反应的这种

配对的存在的一些误差

所以一般来说我们选择的镁离子

大约是从1.5毫摩大约到4毫摩

我们都可以选择

用于我们的PCR的反应

那么这实际上是我们可以看到

我们通过选择不同的镁离子

实际上得到了不同的PCR反应的

最终产物的含量是有不一样的

那么我们可以看到

对于这个特定的反应而言

其实在镁离子浓度达到了

大约是2左右

基本上就得到了一个非常好的

一个PCR扩增的一个结果

同时我们在进行PCR反应的时候

我们还需要对我们的各种条件

进行一定的优化

来得到最佳的PCR的反应

那么在这个里面

我们所需要考虑的一些优化条件

第一个是我们的引物的选择

第二个是我们进行循环条件的选择

第三个我们是不是要考虑一些助溶剂

同时刚才所给大家介绍的

这种镁离子浓度

都会是我们要进行PCR反应

所要进行的一个优化 一个过程

那么在我们对我们的PCR反应

进行优化之后

接下来实际上是我们需要

对我们的其他的一些反应的温度

或者是特定的这种

需要的一些PCR反应

进行特定的一个优化过程

那么比如说像

所谓的这种touchdown PCR

也就是说我们通过程序化的

对退火温度的一个上升

来得到一个最佳的一个反应产物

同时我们如果在进行PCR反应的时候

我们尽量可以选择一个冷启动

也就Cold Start

保证我们整个的反应都在

在变性之前都在一个冰上能够保证

所谓的活性能够达到一个最佳的状态

同时我们还可以

在进行PCR的反应的时候

可能我们需要一个所谓的Hot Start

那么这个Hot Start

也就是说我们在denature之前

我们需要进行一个高温的一个过程

那么这种高温的过程

能够使我们的这种

就是说我们的PCR的反应

所需要的DNA聚合酶

进行一个激活的一个过程

同时我们也可以看到

我们在进行退火温度的选择

大家可以看到

实际上我们这是一个

选择不同的退火温度

那么我们得到的产物

实际上也有不同的产物的

最终的产物实际上含量是有不一样的

那么在这个反应里面

我们最终得到实际上最佳的温度

实际上大约是一个60摄氏度

是一个最佳的一个退火的一个温度

同时我们在进行一个PCR反应的时候

我们还需要考虑各种污染

所带来的这种PCR反应的一个失败

那么所以比如说我们的反应的仪器

包括所谓的这种匀浆机

以及相应的其他的这种反应产物

我们都需要进行考虑

同时我们在我们的所谓的这种试剂

以及实验室的环境都需要考虑到

关于PCR的应用的时候

我们可以应用在基因的鉴定

DNA的测序

以及基因的突变的测定等各个方面

我们都可以用PCR的过程来实现

同时在基因的表达过程中

我们也可以用所谓的这种

实时荧光定量PCR

来进行这个基因的这个表达

以及rtPCR来实现这个基因的表达的

测定的一个过程

关于这一部分章节的分享

我们今天就到这