4.2 病原介导的新型泛素化反应机制1在线视频

同学们好

在前面的课程当中

我们介绍了经典的泛素化过程

以及在催化经典泛素化过程当中

很重要的E3泛素连接酶复合体

CRL的结构和功能

那么从今天开始

我们将介绍病原介导的一种新型的

泛素化反应的机制

这个是与常规的泛素化

有明显的区别的

首先我们还是回顾一下

泛素化是一种非常重要的

蛋白质翻译后修饰

它可以参与比如说细胞周期调控

细胞的转录以及DNA的修复

还有像细菌侵染等等各种过程

那么在常规的泛素化反应过程当中

需要E1 E2和E3这三个酶的级联作用

最终催化泛素分子转移到底物蛋白上

在这个过程当中需要涉及到用到能量

因此需要ATP分子

并且泛素转移到底物蛋白上的时候

泛素是通过它76位的甘氨酸残基的羧基

和底物分子

某一个赖氨酸残基上的氨基之间形成的

异肽键的方式连接的

而在2016年的一篇文章当中

来自普渡大学的罗兆庆教授研究组

他们发现嗜肺军团菌的一种效应蛋白

叫做SdeA它可以以单个酶的形式

直接催化泛素分子连接到底物蛋白上

在这个过程当中不需要ATP分子

反而需要的是NAD这种辅酶

同时在这个过程当中

他们发现泛素分子

并不是通过76位的甘氨酸的残基

连接到底物蛋白上

而是通过它42位的精氨酸

连接到底物蛋白上

因此从需不需要ATP

以及是否是泛素分子的

76位的甘氨酸连接的蛋白

以及是否需要三个酶的角度

这种新型的泛素化过程

与常规的泛素化

都出现了非常明显的区别

那么这种新型泛素化反应

是如何发生的呢

接下来的研究表明

这种新型泛素化反应

得益于SdeA蛋白的两个结构域

分别叫做mART结构域和PDE结构域

这张图显示的是SdeA的全长的

蛋白质结构

一共1499个氨基酸

其中第二个结构域是PDE结构域

第三个结构域是mART结构域

那么在催化过程当中研究发现

首先SdeA会利用它的mART结构域

催化NAD上面的ADP核糖的这一部分

转移到泛素分子42位的精氨酸残基上

并脱离下烟酰胺的这一个部分

因此形成了ADP核糖所修饰的泛素分子

我们称之为ADPrUb

接下来ADPrUb会在SdeA蛋白

PDE结构域的介导下和底物进行连接

具体过程是底物上某一个丝氨酸的羟基

对ADPrUb结构域当中的磷氧键

进行进攻

最终形成了一个磷酸和核糖连接的

泛素42位的精氨酸

与底物某一个丝氨酸的羟基之间

形成连接物的这样一种泛素化的结果

最终脱离掉的是AMP分子

那么在这里大家要注意

这种在表观上

也是形成了底物蛋白的泛素化

但是泛素并不是通过

它76位甘氨酸的羧基和底物分子

某一个赖氨酸的氨基之间

形成异肽键而连接上的

反而是通过泛素分子上42位精氨酸

和底物蛋白上

某一个丝氨酸的羟基之间形成的连接

而且二者还并不是直接连接

之间通过了磷酸和核糖的介导

因此这就是新型泛素化反应

与经典的泛素化反应的

一个典型的区别

那么这样SdeA蛋白

是如何来催化这个过程

是以一个什么样的结构

来催化这样一种功能

我们研究组解析了SdeA蛋白的

活性结构区的基本结构

如图所示

这个结构当中包含了

绿颜色的mART结构域

包含了橙色的PDE结构域

以及黄颜色的C端结构域即CTD

从结构当中我们可以看到

mART结构域和PDE结构域相互作用

并且二者坐落在C端结构域之上

那么我们所做的结构研究的片段

并不是SdeA的全长

因此在研究中我们首先研究了

我们所包含的这一个片段

是否具有全部的酶活

在酶活实验当中

我们发现我们所做的SdeA的片段

具有与全长的SdeA蛋白相同的酶活

因此也就证明

我们这一段的SdeA的活性

是非常正常的

接下来我们分析了

SdeA蛋白的活性结构域的具体的结构

前面已经介绍了

它的两个活性结构域

mART和PDE之间是彼此相互作用的

那么我们首先分析了

它们是如何来进行相互作用的

我们发现SdeA的mART结构域

是一段两个螺旋和一段loop

形成的结构

插入到了PDE结构当中

在这个过程当中

二者形成了一个紧密的相互作用

既然有了相互作用

我们当然很关心的是

这种相互作用对于二者的酶活

是否是必须的

通过后续的活性实验

我们发现这一个相互作用

对于PDE结构域的活性

并不是必须的

因为当我们把SdeA的PDE结构域

单独纯化出来之后

我们发现它具备自身的酶活

即催化第二步反应的泛素化过程

那么它如何来催化第二步反应的

泛素化过程如何来检测

我们当然要给它提供第一步泛素化

新型泛素化反应的第一步

会产生的产物

让它来作为底物来进行催化

我们发现PDE结构域活性是正常的

但是与之相对应的是

当我们把单独的mART结构域

拿出来之后

发现它的活性是消失的

它不具有自身的活性了

而它必须要与PDE结构相互作用

才会具有相应的活性

我们做了类似的实验

在mART结构域当中加入PDE结构域

我们发现它可以恢复mART它的活性

从而证明了SdeA的mART结构域

是需要PDE结构域的作用

才能够稳定的具有相应的活性的

接下来我们的研究重点

放在了SdeA的催化

第一步反应的mART结构域上面

我们首先分析了

mART结构域的结构

我们看到它的结构当中

基本上分成两大部分

左侧的是一个以α螺旋为核心的

这一部分

我们称之为α helical lobe

而右侧的是一个活性结构域

我们称之为active lobe

那么这两个结构部分之间

形成了一个大的凹槽

目前没有结合任何的物质

通过分析结构我们发现

它具有比较经典的mART结构

都具有的特征

比如说ARTT loop

PN loop

同时它也具备其他的mART结构中

不具有的特征

比如说前面介绍的

插入到PDE结构域里面的

我们称之为插入结构域

或者叫Plug loop

那么首先我们对SdeA的mART结构域

与数据库中其他蛋白质的

mART结构域

进行了结构的比对

通过结构比对

我们发现 mART SdeA的mART结构域

相比于其他的结构域而言

还是具有自身的特点的

这体现在它的ARTT loop PN loop上

与其他的结构还是有明显的区别的

同时其它的结构当中

也不含有Plug loop

这些都是SdeA结构域的

SdeA的mART结构域

所具有的自身特点

那么结构决定功能

因此它的这些自身特点

就决定了这些位置

可能会发生特有的功能

而赋予SdeA的mART结构域

它独自的活性

那么mART结构域的活性是什么呢

是催化泛素分子的第一步的修饰

修饰上ADP核糖的这一个部分

因此我们研究了mART结构域

与泛素分子的复合物的结构

如图所示

在这个结构当中

绿颜色和紫颜色分别代表的是

SdeA的mART结构域

和它所结合的泛素分子

而灰色代表的是

未结合泛素的mART结构域

通过结构比对可以看出

mART结构域在结合了泛素之后

发生了明显的构象变化

这些构象变化

可能与泛素分子的相互作用密切相关

我们同时也可以看到

泛素分子跟mART结合的一些结构细节

一些重要的参与相互作用的

氨基酸残基

在分析相互作用的过程当中

我们发现泛素分子

参与结合mART

主要是利用它两个精氨酸残基

分别是它72位和74位的精氨酸残基

我们都知道

精氨酸残基是带有正电荷的在侧链上

而通过表面电荷分析

我们发现mART结构域

表面上有两个带负电的凹槽

这两个凹槽刚好适合

带正电的泛素上的

72位和74位的精氨酸残基去结合它

因此泛素分子结合到mART上

是利用它72和74位的

这两位两个精氨酸残基来参与结合的

那么反过来泛素分子的

72位和74位的精氨酸残基

对于泛素的活性也是极为必要的

在这里面我们通过突变体实验

发现72和74

这两位精氨酸残基的单点突变

就可以使得泛素分子

失去参与这种新型泛素化的活性

在这个过程当中前面已经介绍了

泛素分子的42位的精氨酸要被修饰

因此42位精氨酸的突变

也会导致泛素的活性失活

这也就进一步的验证了结构的准确性

也就是我们知道了泛素的42 72和74

这三个氨基酸都极为重要

反过来我们也分析了

SdeA的mART结构域

参与结合泛素的

一些关键的氨基酸残基

并对之进行了突变的研究

我们发现突变了这些氨基酸残基之后

SdeA的mART结构域

也不具有催化新型泛素化的能力了

从而验证了二者之间的相互作用

同时SdeA蛋白在酵母中是具有毒性的

即抑制酵母的生长

我们发现

当把SdeA的mART结构域上面的

关键参与结合泛素的氨基酸残基

突变之后

SdeA也不具有酵母毒性了

这些都验证了这些残基

是参与结合泛素的重要位点

接下来我们还研究了

SdeA泛素和NAD复合物的结构

在这个研究当中

我们尝试获得SdeA泛素

和NAD复合物的结构当中

遇到了很大的问题

但是后来我们发现

与NAD极为类似的另一个物质

NADH它是可以作为反应的

一个抑制剂来抑制这个反应的

同时我们很顺利的获得了

SdeA泛素和NADH的复合物的结构

我们发现前面所介绍的凹槽

正好就是NADH的结合位点

接下来我们分析了NADH

参与结合的一些

SdeA mART的结构域上的氨基酸残基

同样的发现它们的突变

可以抑制SdeA mART的结构域的活性

同时也可以抑制SdeA的酵母毒性

同时也通过分子相互作用的手段

验证了这些残基的突变

也可以极大的影响

SdeA mART的结构域

结合NAD的能力

从而印证了结构的准确性

同时我们还发现上述的这些突变

不管是破坏SdeA mART结构域

与泛素结合的

还是破坏SdeA mART结构域

与NAD结合的

它们都不会影响SdeA的另一个结构域

PDE结构域的活性

这也是一个补充的验证

那么这个结构里面

最有意思的一点是在于

我们知道SdeA修饰的是泛素的

42位的精氨酸

要把它加上

ADP核糖的这样的一个部分

但是在结构中惊奇的发现

SdeA的结合的泛素结构里边

泛素42位的精氨酸距离它要修饰的

或者说他要进攻的NAD的位置

距离非常之远

达到了11.7个埃

而相反

泛素的72位的精氨酸

却距离要进攻的位点非常近

只有四点几个埃

因此这与之前的实验结果

是存在着一定的矛盾的

那么为了解释这个矛盾

首先我们通过分子动力学模拟的方式

把NADH替换成了NAD

进行了一轮分子动力学模拟

发现72和42位精氨酸的位置

并没有发生改变

接下来进一步的调研文献发现

在催化类似活性的结构当中

有一类2013年的一篇文章当中

明确的指出

在这类反应当中

NAD里边的烟酰胺的基团

会和ADP核糖连接的部分

会自发的发生一下断裂

之后才能进行接下来的反应

因此我们也做了类似的

在分子动力学模拟

做了类似的操作

即断开烟酰胺和ADP核糖之间的

连接部分

然后进行分子

分子动力学模拟

这一次在模拟的过程当中

我们发现42位的精氨酸的残基

从原来距离要进攻的位点

为11.7个埃

经过分子动力学模拟之后

达到了4.4个埃在整个过程当中

72位的精氨酸残基会离开活性位点

而42位的精氨酸残基

会随之摆动进来

实现了这样的一个构象变化

那么这种构象变化是否会真实发生

或者是否有可能发生呢

我们还调研了数据库中

已有的泛素分子的结构

把它们进行了比对

在比对之后我们发现

泛素分子的42位的精氨酸残基

确实可以呈现多种不同的构象

这也支持了42位精氨酸残基

很可能在反应过程当中

会发生一个构象变化这样的观点

以上就是我们已经介绍了

泛素分子是如何与

SdeA的mART结构域相互作用

并且SdeA的mART的结构域

是如何来介导泛素分子的

ADP核糖基修饰的

那么被ADP核糖基修饰的泛素

接下来就要被第二步反应的结构域

PDE来进一步的处理和作用

那么这一步是如何发生的

我们下一节的时候再来介绍