3.4.2 蛋白质结构的研究流程之蛋白质结晶2在线视频

大家好

上一节我们讲到了

蛋白质结晶条件的摸索

我们说大体思路

是先设计一系列的初始条件

尝试晶体生长

然后一旦获得晶体之后

再仔细的进行优化

然后直到获得大的单晶为止

这是蛋白质结晶条件摸索的

一个基本的思路

那么如何来进行初次的筛选

initial screen呢

目前最通用的方式

我们会进行这种

稀疏矩阵筛选的方式

什么叫稀疏矩阵筛选呢

我们首先分析已经获得的

已经报道的

这些蛋白质晶体生长的条件

然后我们根据不同的目的

从中挑出来若干种

那么这些种

都曾经报道过蛋白质晶体的生长

也就是是已知的晶体生长的条件

因此我们基于的一个假设就是

我们现在所做的蛋白质的晶体的筛选

可能会在

或者是直接就在之前

某个晶体生长的条件当中

或者是它会跟之前已经报道的

某个晶体条件很相似

因此我们将这些已经报道的

蛋白质晶体生长的条件

给它组成一个试剂盒

然后我们每拿到一个新蛋白质的话

就去试新蛋白质能不能在试剂盒

所列的这些条件里面去生长

这样可以极大的节约时间

因此这也就成为了

蛋白质晶体生长条件筛选的

一个首选的方法

那么这里我就给大家列举了一个

蛋白质商品化的

蛋白质结晶试剂盒的主要成分

我们可以看到一共有三列

分别是盐 Salt Buffer

也就是提供pH的缓冲剂

还有就是沉淀剂Preclpltant

那么基本上

所有的结晶条件

都是由这三种成分来组成

它可能会具体到某一个条件

会缺失某一种或者是某两种

或者是具体这个条件

在某一种比如说盐这里面

它会有多种盐的一个混合物

或者是在Buffer这里边

是多种pH值缓冲剂的混合物

或者是多种沉淀剂的混合物

但是它都是无一例外的

是至少要包含这三种的这样的成分

就是盐 缓冲剂和沉淀剂这三种成分

那么如果我们在晶体

稀疏矩阵筛选的情况下

没有得到我适合的结晶条件

这种情况也是有可能发生的

比如说我的结晶条件

适合在30%的PEG3000里边生长

但是稀疏矩阵法的试剂盒当中

恰好没有30%的PEG3000

而只有25%的PEG3000

和35%的PEG3000

那么很有可能我就没法

通过试剂盒的筛选

获得我的结晶条件

这种情况应该怎么办

我们通常会用网格筛选法

在网格筛选法里面大家注意

它的横竖两列

分别变动蛋白质的沉淀剂浓度和pH值

因此我们就会得到多个沉淀剂浓度

对应多个pH值的结晶条件

同时我们在尝试不同的蛋白质的浓度

这样基于这三个方向

来进行一个网格的筛选

这样就可以对试剂盒当中的很多条件

进行进一步的细筛

这是一种应用方法

另一种方法就是

我们如果通过试剂盒的筛选

获得了一个结晶的条件

但是结晶条件长出来的晶体不够好

我们要进行晶体的优化

也可以用这种网格筛选的方式

把我结晶条件放在网格中间

左右的这样的一个位置

然后我在条件基础上

变动它的沉淀剂浓度

变动它的pH值

再改变蛋白质浓度

从而进行蛋白质结晶条件的优化

这两种情况

都适合用网格筛选法来进行

还有一种方法先给大家介绍的是

蛋白质晶体生长的共晶法

它的基本目的是

为了研究蛋白质与其大分子配体的

相互识别与作用机理

比如说我想研究

蛋白质跟DNA的相互作用

我想研究抗原抗体的相互作用

或者是蛋白质跟某一种结合蛋白的

相互作用等等

这些我都可以用共晶法的方式

来进行二者复合物的晶体

实践经验表明

通过共晶法来制备复合物的晶体

对配体之间的亲和力的要求

并不是很高

共晶法又叫co-crystallization

那么共晶法除了

可以应用于这些场景之外

还有一个很重要的方面是

当我想纯化得到的一个蛋白质

没法完全纯化到

或者是我纯化得到的蛋白质

生长晶体

没法获得蛋白质的晶体的情况下

我都可以采用

加入与它结合的一个蛋白的一种方式

来帮助我蛋白质的纯化

或者帮助我们蛋白质的结晶

比如我们自己的实验室里面

就有很多这种例子

当我做一个蛋白质的结晶

没法获得它的晶体的时候

我如果加入一个

能够和它确定结合

稳定结合的蛋白质

有时候可以很容易的获得

这两个蛋白质的复合物的晶体

反而加快了结晶的进程

这是因为在结晶的过程当中

需要蛋白质能够保持稳定的状态

而如果想让一个蛋白质

保持稳定的状态的话

它如果能找到一个

与它结合的小分子

或者与它结合的蛋白质的话

加进去可能就可以很好的稳定住

我这个目标蛋白质

从而方便蛋白质的结晶

因此蛋白质的共晶法

不仅可以

你以这个来研究蛋白质的

相互识别为目的

同时也可以在你没法获得

你想要蛋白质的晶体的时候

加入蛋白质的相互作用的

我们称之为Binding Partner

这样来帮助我这个目标蛋白质的结晶

还有蛋白质晶体生长

还有适应的接种法

叫做seeding的这种方法

它的一个基本原理是

我目前已经获得了

我这个目标蛋白质的晶体

这样的话我可以将这个晶体给它打碎

打碎了之后

作为晶种接种到一个新的溶液当中

当然在这个溶液当中

我预先要加好我的目标蛋白质

和结晶的池液 之后

目标蛋白质就有可能围绕着

我提供的晶种

来进行晶体的生长

从而长大长好

同时这种方法也适合于

比如说我没有获得

我这个目标蛋白质的晶体

而我有一个和我们目标蛋白质

同源度非常高的蛋白质的晶体

这个时候

我也可以将我同源蛋白质的晶体

打碎了之后作为晶种

提供给我的结晶的池液

让目标蛋白质围绕同源蛋白质的晶种

来进行生长

当然这种前提是

二者的同源度需要非常的高

同时预测的结构应该也是比较相似的

才适合用这种异源接种的方法

我们称之为异源接种

因为这是将另一种蛋白的晶体

作为晶种提供给这种蛋白质

所以异源接种的方法

适合于同源度很高的两种蛋白

预测结构很相似的两种蛋白来进行

接下来介绍一下

影响蛋白质结晶的因素

主要有以下几点

第一点蛋白质的纯度

Purity of proteins

蛋白质的纯度需要较高

一般要高于95%

适合做蛋白质的结晶

第二 蛋白质的浓度

蛋白质的浓度前面已经介绍了

它直接会影响蛋白质结晶的结果

如果蛋白质的浓度较低

可能在绝大多数的条件下

蛋白质都存在于未饱和的这种状态下

没法结晶

而如果蛋白质的浓度太高

那么会导致在大多数的条件下

蛋白质都会析出沉淀

也没法获得蛋白质的晶体

因此需要摸索一个

合适的蛋白质的浓度

不过高也不过低

从而让它能够从不饱和到饱和的状态

进行转变

第三是叫做

Starting conditions

就是用来结晶的蛋白质

所在的溶液成分

这当然是最后一步纯化蛋白质

所用的溶液成分

因此我们在选择最后一步纯化的时候

一定要非常的小心

第四 沉淀剂

这是直接影响蛋白质结晶的

一个关键点

第五是温度

通常情况下

我们选择的温度一般是18~20摄氏度

第六 pH值

指的是结晶池液

以及蛋白质所在溶液的pH值

它可以影响蛋白质的电荷状态

从而影响蛋白质的结晶

第七叫做Additives添加剂

这个添加剂的种类就非常广泛

比如说去垢剂

还原剂 底物 辅因子等等

这些都可以作为添加剂

来进行加入到蛋白质的结晶过程当中

大家注意

添加剂的使用

有时会出现意想不到的效果

比如说我的蛋白质的衍射能力较差

但是可能加入某一种添加剂之后

就会让蛋白质的结晶

变得非常的快速和非常的

结出来的晶体质量非常的高

这个往往是因为我加入的添加剂

可以有效的结合在蛋白质的

某一个位点

稳定住这个蛋白质

而很有可能这个添加剂

也是这个蛋白质的某一种底物

某一种辅因子或者某一种必需的成分

接下来是蛋白质结晶的

一个常规的思路

首先蛋白质的浓度的选择

一般情况下我们会选择

5~20个毫克每毫升的浓度的蛋白质

来进行蛋白质的结晶实验

当然依据不同的蛋白不同

可选的浓度

也可以低一些或者是高一些

但是总而言之要维持蛋白质

不要过早的达到过饱和的

这样一个状态

第二个 纯度

通常情况下最简便的方法

是通过SDS-PAGE

蛋白质凝胶电泳来验证蛋白质的纯度

达到95%左右的纯度

就可以进行后续的结晶了

当然我们前面介绍了

这样只是保证了

蛋白质的化学组成均一

而想要结晶的蛋白质

还需要分子构象均一

如何能实现分子构象均一呢

指的就是蛋白质分子

要以相同的状态存在于溶液当中

这种情况下

我们一般会用动态光散射

即DLS的方法

来检测蛋白质的聚集状态

看蛋白质是否

都已几乎同一相同的状态

存在于溶液当中

第三个是表达的标签和纯化的方法

通常情况下我们认为这个标签

蛋白质带的标签越小越好

因为蛋白质带的标签越小

就越不会对蛋白质的结构

造成严重的影响

通常情况下我们认为6个组氨酸

形成的组氨酸标签是合适的

可以接受的

但是当然也有一些例子

我这个蛋白质带上了组氨酸标签之后

不能够结晶

而去掉了这个组氨酸标签之后

就可以很容易的结晶了

所以大家在做结晶的时候

要考虑到这一点

那么GST标签即谷胱甘肽硫转移酶

是一个220个氨基酸左右的蛋白质

那么一般情况下

我们认为带着GST标签的蛋白质

GST标签可能会影响

我的目标蛋白的构象

因此一般会选择切掉它

但是凡事都有两面性

有的时候我这个目标蛋白质

不容易结晶的时候

给它带上一个GST标签之后

反而会更加容易的产生结晶

这是因为GST蛋白本身

具有容易结晶的性质

因此它可以带着我这个目标蛋白

来进行结晶

所以大家在进行

结晶的蛋白质的标签选择的时候

要多加注意

要多考虑到不同的情况来进行选择

最后一个就是

Final steps of purification

即纯化的最后一步

我们知道在蛋白质纯化过程当中

会用到多种缓冲液

但最后决定蛋白质是否能够结晶的

其实是最后一个步骤的缓冲液

在这步缓冲液的选择中

我们一般用常规的Tris和氯化钠

作为两个主要成分

当然也可以有所调整

但是大家要注意

在最后一步纯化的缓冲液会最终决定

蛋白质结晶的时候所处的状态

下面是一些结晶常见的问题

首先第一个

其实也是蛋白质纯化中常见的问题

蛋白质不是非常的可溶

也就是not highly soluble

这种情况下

我们就没法浓缩蛋白质到较高的浓度

这种一般是什么原因导致的

一般我们认为它是全部的

或者是一部分的折叠的不够好

或者叫

wholly or partially misfolded

或者另一种情况是

目标蛋白质缺少一个结合的蛋白

就是我们前面所说的

它缺一个binding partner

或者是稳定它的一个底物

因此这种情况下

我们一般去寻找一个

蛋白质可能结合的物质

可能结合的蛋白质

或者是结合的底物加进来

一起来进行蛋白质的纯化

这样可能就能让蛋白质

提高它的可能性

从而能够达到浓缩到很高的浓度

同时我们也可以采取

换一个来源的蛋白质的这种方式

比如说我们想研究

某种酶的结构和功能

那么我可以选择另一个物种的

来源的酶

来进行蛋白质的结晶

和后续的结构研究

第二个方面叫做蛋白质不结晶

这种也是很常见的

一般情况下我们认为

蛋白质不结晶

是源于蛋白质有超过一个的结构域

并且结构域之间

是以非常灵活的linker来进行连接的

这样的话可能导致它在水溶液当中

没法稳定的形成这样一个

周期性排列的晶体

第二个 蛋白质有可能

它的氮末端或者是碳末端

是这种无序的状态

也会导致蛋白质不结晶

这种方法我们可以采用

限制性的蛋白酶切

或者是重新克隆蛋白质其他片段的

这种方式来进行解决

第三个 蛋白质的晶体长出来了

但是晶体它是not well ordered

也就是它的衍射能力不强

这种情况下

一般是认为晶体中蛋白质的接触面

还是比较 flexible

导致它堆积的不够严谨

所以导致它的衍射能力不强

这种情况我们一般采取的方式是

突变蛋白质的表面的氨基酸残基

或者是更换蛋白质的来源

从其他的物种中

去选取蛋白质来进行结晶

这样就可以提高晶体的衍射能力

使得蛋白质的晶体的衍射能力更强

以上都是结晶常见的问题

和一些简单的解决措施

下面看一下常见的结晶的实验结果

最左上角的这一个

Clear状态

就是典型的蛋白质未饱和

没有达到饱和的状态

接下来是蛋白质的沉淀

然后是蛋白质的Phase Separation

当然Phase Separation

可能是蛋白质的相分离

也可能是结晶池液中成分的相分离

接下来是Spherulite

我们称之为类晶

还未形成晶体的这样的一个状态

称为类晶

而下面这一排则全部都是

蛋白质结晶的各种不同的形式了

左侧的叫做Needles

针状的晶体

接下来是Plate Cluster

薄片状的晶体

以及其他的片状晶体

和Prism这种晶体

当然如果我们的筛选

或者是优化的结果

得到了Prism这种形状的晶体的话

一般来讲

你的蛋白质的结晶的衍射能力

一般会比较强

接下来是同一个蛋白质

是有可能在不同的条件下长出晶体的

比如说这个图中所显示的这种蛋白质

它可以在不同的结晶条件下

都形成晶体

并且这些晶体的状态和形状

还各不相同

那么在不同条件下结晶长出来的晶体

它们的解析出来的结构是相同的吗

有人做过类似的实验

发现虽然在不同条件下

长出的蛋白质的晶体的形状各不相同

但是解析出的结构

基本上是完全一致的

尤其是在它活性位点区域

是非常相符合的

因此这也就意味着

尽管一个蛋白质

可以在不同的条件下来结晶

但是它们长出的晶体

对应解析的结构

是完全的非常的高度同源的

这也就使得结构生物学的学科

其实是非常精确的这样的一门学科

好 利用这节课

以及之前几节课的内容

我们已经介绍了

蛋白质结构的研究流程中

最重要的两部分

蛋白质的表达纯化以及蛋白质的结晶

这两部分内容

我们今天的这一个课也就讲到这里

谢谢大家