2.2 PCR基因扩增在线视频

我是来自于北京化工大学

生命科学与技术学院的罗施中

下面我们讲述

关于PCR应用的这一章节

那么关于PCR的应用

我们主要从以下三个方面

来给大家进行讲解

第一个是用一些非常规的碱基

来应用于PCR的过程

第二个是通过PCR来进行基因的克隆

第三个部分是关于

通过PCR来进行基因的突变

那么用非常规的一些碱基

它主要的目的是干什么呢

它主要的目的是

用于检测PCR的一些产物

通过这种改变引物的选择性

以及它的相互作用的作用力

来进行对链式聚合酶的功能

进行一定的改变

那么关于使用一些非常规的碱基

主要是有以下两种

第一种是所谓的这种碱基的

修饰的碱基

第二个是修饰的dNTP方法

那么关于修饰的碱基

主要是通过修饰的碱基过程中间

加入一些标记来用于检测

那么同时也可以在3’端

引入一些磷硫键的方式

来阻断DNA聚合酶

3’端到5’端外切酶的活性

同时我们通过引入一些

不配对的一些碱基

我们可以应用于基因的克隆

以及基因的突变的过程中

那么在我们进行

非常规的碱基的过程中间

我们主要要注意的事项是什么呢

第一个是我们在引入

一些非常规的碱基过程中

我们必须要保证

引物的高的选择性和稳定性

同时一般来说

我们加入的这种修饰

一般是在引物的5’末端

同时我们在引入非常规的碱基之后

我们要注意

要改变它的退火的温度和时间

第二个是如果我们要引入

一些修饰的dNTP的时候

那么我们主要是应用于

对PCR的产物进行一些标记

你比如说dNTP中间对其中的磷

通过磷32的标记

以及相应的一些biotin的标记

以及荧光的标记

那么来对我们的产物

进行一些检测的过程

那么在进行dNTP

修饰dNTP的过程中间

我们必须要保证

同时我们要加入一些未修饰的碱基

从而保证我们的修饰

不会对我们的聚合反应

产生一定的抑制作用

那么接下来我们来给大家讲一讲

是我们如何利用PCR来进行

DNA的一个基因的克隆的过程

那么对于基因的克隆

我们主要是分为两种

一种从我们的这种genomic DNA上面

对我们感兴趣的片段

通过PCR的过程

引入到质粒的DNA中间

同时第二种是我们从其中的

比如说一些特定的质粒的DNA中间

把我们感兴趣的DNA片段PCR出来

到另外一个其他宿主的

使用的一些质粒DNA过程中间

那么在我们如何进行

基因的PCR的片段扩增过程中间

我们可以通过在设计引物的时候

直接引入一些酶切的

限制性内切酶的酶切位点的方式

来将我们感兴趣的片段

引入到质粒中间去

那么比如说在我们的双链DNA

感兴趣的双链DNA过程中间

含有的有两个酶切位点

那么我们在设计引物的时候

把这两个酶切位点所包含的引物

进行设计

然后通过一个PCR的反应

那么最终得到了

我们感兴趣的这个DNA的片段

同时我们的酶切位点

也包含在这个片段的扩增片段中间

那么最终呢

通过限制性内切酶的酶切作用

得到我们所需要的粘性末端引入到

我们另外的一个质粒过程中间去

第三个应用

我们通过PCR

应用于这种基因的突变过程中

那么基因的突变

第一种是我们所谓的这种

位点特定的这种基因突变

那么这种我们可以应用于

通过在引物中间直接引入的方法

或者是这种Overlap Extension的

这种突变的方法

或者是超大引物的突变方法

以及QuikChange的这种突变方式

第二种是所谓的这种

切除的这种突变方式

PCR的这种融合的方式

或者是反转PCR的方法来实现

那么下面我们分别简单介绍一下

这几种方法是怎么来实现

这种基因的定点突变

第一个是所谓的

Overlap Extension的

基因突变的方法

那么首先我们需要两步的PCR反应

那么同时我们需要设置四个引物

在这四个引物的过程中间

第二引物和第三引物分别包含有

我们所需要进行基因突变的

这么一个碱基片段X

那么在第一步的PCR反应过程中间

我们需要把一和三作为引物

得到我们所需要的A片段

那么在A片段中间

我们可以看到其中的单一的位点

已经突变成为X了

第三和第四引物作为引物的话

那么我们得到了B片段

同样B片段中间的专一位点的X

已经引入到我们的这个片段中间

然后我们把A和B进行一个混合

然后再进行延伸

最终我们再进行一步PCR的反应

以一和四作为引物

那么通过这步PCR反应

得到我们所需要的

包含有定点突变X的

这么一个PCR的片段

接下来我们还可以通过大引物的方法

把我们需要进行定点突变的

位点的碱基引入到我们的片段中间去

那么首先实际上我们也可以看到

我们需要设计两个引物

其中的第一个引物中间包含有

我们需要进行突变的碱基

那么以一和二为引物

得到了我们其中的

包含有定点突变位点的X的

这么一个片段

然后对这个片段进行一个分离的过程

得到了一条非常长的一条A链

那么这条A链中间就包含了

我们突变的位点X

然后我们进行第二步的PCR反应

那么我们以设计的第三条引物

和我们分离得到的这么一个A片段

非常大的一个大异物作为引物

那么这样的话我们再进行PCR的反应

就得到了我们所需要的这个片段

那么在这个片段过程中间

它就包含了我们需要定点突变的

这么一个x的碱基

在此基础上

我们还可以进行一个

修饰的一个大片段的一个方法

在这步大修饰的大片段的方法中间

我们也需要进行如下的PCR反应

第一是我们需要设计一个第一个引物

在这个引物中间包含有

需要定点突变x的这么一个碱基

同时我们也需要设计一个第二个引物

那么第二个引物它包含有一个

我们所需要和这个模板配对的

这么一个片段

同时还有一个A片段

那么这个A片段就用于

我们后续的一个PCR的过程中间

那么在进行第一步的PCR作用

我们可以得到

如图所示的这么一个片段

然后我们在此基础上

我们再进行一个

PCR的一个延伸的过程

得到我们所需要的一个初步的

一个PCR的片段的前体

最终我们在以第三个引物和A

能够以A作为一个引物

来进行一个PCR的过程

那么这样的话

就可以得到我们所需要的

引入了定点突变x碱基的

这么一个片段

那么最后我们给大家讲一个

非常简单的

一个叫QuickChange的

位点定点突变的

这么一个基因突变方法

那么在突变的方法中间

我们可以看到

对于一个环形的这种圆形的

这种环状质粒来说的话

那么如果我们要对其中的

单一的一个位点进行突变的话

我们首先需要设计两条引物

那么这两条引物是相互自我配对的

同时包含我们所要引入的

定点突变碱基的这么一个引物

那么这个引物首先进行

以我们所从菌种里面提取得到的

一个质粒作为模板

以含有定点突变碱基的这么一个引物

作为引物

进行一个PCR的过程

那么通过这一步PCR的过程

我们得到了两条新的

含有位点突变的这么一个片段

那么这个片段得到之后

然后根据从菌种里面

所提取得到的一个质粒中间

包含有甲基化的这种片段

那么如果我们加入了一个

专一性切割甲基化片段的

这种限制性内切酶

也就是称之为DPNⅠ的话

那么这样的话

它就会把原始的粒给它切除出去

切除出去之后

然后我们把我们PCR得到的

这么一个新的片段

然后把它转入到我们所需要的宿主

比如说大肠杆菌

然后通过大肠杆菌自身的

一个自我的复制作用

得到我们所需要的这么一个质粒

那么这个质粒里面我们可以看到

由于这个引物过程中间

已经引入了单位点的这个突变

那么这样的话我们的质粒就本身

通过扩增就得到了

含有定点的单碱基突变的

这么一个突变好的一个质粒

同时我们前面给大家讲的是

我们进行一个定点的突变

接下来我们给大家介绍

实际上是我们如何进行一个

对这个基因进行一个切除的

比如说我们不感兴趣的片段

如何把这一段片段给它切除出去

那么这举了一个例子

实际上

如果我们在我们的目标基因里面

对其中的比如说这一个片段

进行突变的话

那么我们首先会设计一个特定的引物

那么引物它既可以

和前面的这个红色片段进行配对

也能够跟它所切除的下游的

这么一个片段进行配对

那么这样的话通过设计这个引物

和它下游的下游引物

进行一个PCR的过程

那么这样的话

通过这一步PCR的反应

就可以把我们所需要切除的这个片段

给它切除出去

如图所示

这是通过一个称之为PCR融合的方法

把我们的目标基因给它切除出去

那么我们需要设计一些特殊的

这么一个引物

它能够包含有切除片段的前半部分

和5’端部分和3’端部分

那么通过特定的这么一个PCR的反应

然后得到我们所需要的这两个

既包含有上游的片段的一个A片段

和下游的一个B片段

然后最终把这两个片段

通过一个融合的方法

然后进行PCR的一个延伸过程

最终得到我们所需要的

切除了中间需要切除的目标基因的

这么一个目的片段

最后一个方法

我们也可以通过

反转PCR的方法来实现

将特定的DNA片段切除出去

那么也就是我们在设计引物的时候

恰好把我们所需要切除的这一边

不包含在我们的引物的PCR过程中间

那么通过这一步

简短的PCR的方法

然后实现把其中的

不需要的这个片段切除出去

那么以上就是我们通过PCR

通过所谓的这种PCR融合的方法

或者反转PCR的方法

实现了特定的DNA切除的目的

那么关于PCR的应用的章节

我们今天的讲解就到这里