3.3.1 蛋白质结构的研究流程之蛋白质纯化1在线视频

好 上一节我们讲到了

蛋白质结构的主要的研究流程

是先选择目标基因

之后通过亚克隆的方式

克隆到表达载体当中

之后进行蛋白质的表达和纯化

之后进行蛋白质的结晶

那么在获得蛋白质的晶体之后

收集数据

并进行结构解析

从而获得蛋白质的结构

在获得蛋白质结构之后

我们还要进行相应的功能实验

来验证我们获得的蛋白质结构

最后将蛋白质的结构模型

和功能实验整合在一起

来阐明蛋白质的结构及其生化功能

那么从这一节开始

我们就将依次介绍里边的重要的步骤

来介绍具体的

如何来进行蛋白质的结构研究

首先是原核系统表达纯化蛋白的

一个基本流程

因为到目前为止

原核表达系统

还是目前最常用的一个

蛋白质纯化的系统

首先我们在选择了目标基因之后

进行分子克隆

克隆到表达载体当中

之后将这个表达载体

转移到宿主当中

这里边的宿主我们就是最常用的

原核表达的宿主大肠杆菌

之后进行大肠杆菌的培养

培养了之后诱导蛋白质的表达

在诱导蛋白质表达之后

我们获得表达了蛋白质的细菌之后

进行它的破碎 离心

离心之后分离了

上清和沉淀之后

那么一般来讲

我们的蛋白质是位于上清当中

因为是水溶性的蛋白质居多

获得水溶性的蛋白之后

我们将获得的上清通过一个层析柱

在层析柱之上

目标蛋白是以特异性的方式

挂在这个层析柱上

而非目标蛋白

则不挂到这个层析柱上

从而得到流穿

最后我们再用合适的方法来进行洗脱

将我们的目标蛋白

从层析柱上洗脱下来

这个就是原核表达系统

纯化蛋白的一个基本的流程

下面我们来看一下里边的重点的步骤

首先在表达纯化的时候

我们需要用的仪器是

FPLC

即Fast Protein Liquid Chromatography

也就是快速蛋白液相层析系统

当然现在经过了若干年的发展

这个液相层气系统也得到了

不同的更新和换代

但是它的基本原理

都是将液态的蛋白质

注射到这个层析系统中

之后通过Buffer的不断的运转

最终能够获得蛋白质的纯化

那么如何进行

活性状态下的蛋白质纯化呢

因为我们正常情况下

需要得到的蛋白质

还应该是它在活性状态下的

如何来进行呢

我们需要考虑多个蛋白质的性质

来采取相应的纯化手段

蛋白质具有哪些性质呢

首先不同的蛋白质的溶解度不同

Solubility

那么基于它的溶解度不同

我们一般会采用在不同的盐浓度下

来进行沉淀的方式

将蛋白质沉淀出来

这个过程我们也叫做盐析

最常用的盐析的盐是硫酸铵

比如我们可以设置

不同的硫酸铵的浓度

从低到高

那么依次沉淀出来一部分的蛋白质

之后鉴定我们沉淀出来的

每一部分的蛋白质的种类和成分

去找到我们的目标蛋白

在哪一个成分里边

从而获得目标蛋白的纯化

第二方面

不同蛋白质的大小和形状不同

那么基于蛋白质的大小和形状不同

我们可以采用在活性状态下

进行分子排阻层析

或者叫做凝胶过滤层析的方法

俗称分子筛

用这种方法

将大小不同的蛋白质来进行分离

同时不同的蛋白质它的等电点不一样

那么基于不同的蛋白质

等电点不一样的这一个特点

我们可以采用一定的pH

让蛋白质带上一定的电荷

从而用离子交换层析的方式

来纯化我们的目标蛋白

最后不同的蛋白质

可能还具有结合不同的小分子的

这样的能力

基于这种方式

我们可以用采用亲和层析

来通过蛋白质特异性的结合

某种小分子或者大分子的特性

来将目标蛋白与其他的蛋白分离开

那么以上就是我们在活性状态下

进行蛋白质纯化的时候

需要考虑的因素

以及相应的纯化手段

下面我们依次来看

首先我们从顺序反过来说

先说亲和层析

那么亲和层析顾名思义

它就靠的是我们的目标蛋白

与某种物质的特征性的亲和力

来进行蛋白质与其他蛋白质的分离

在这个过程当中

我们平常知道的亲和力里边

最常见的一个亲和力

同时也是非常强的一个亲和力的

就是抗原和抗体之间的亲和作用

当然这也可以发展成一种

亲和层析的手段

但是在这里我们首先介绍一下

亲和层析的基本的步骤

如图所示

我们在一个装载有一定的介质的

这样的一个层析柱材上面

我们给它加入不同的蛋白质

在这个里边

只有这个有一个小开口的蛋白质

是我们的目标蛋白质

而它可以特征性的识别

结合在柱材上面的特异性的基团

而其他的蛋白质由于形状不同

则不能够结合这种柱材

因此我们获得了目标蛋白质的纯化

在获得目标蛋白质的纯化之后

我们还要采取一定的手段

将蛋白质从柱材上洗脱下来

因此通过纯化洗脱这样的一个流程

我们获得了目标蛋白质

与其他蛋白质的一个分离

之后柱材会恢复原状

可以进行下一轮的纯化步骤

那么说到层析的洗脱方式

目前主流的层析洗脱方式

主要有以下几种

首先第一种方法

可能是最简单的一个方法

但是应用上可能受到一定的局限

也就是我通过一个很简单的

改变缓冲液的环境

使得结合在柱材上面的蛋白质

与柱材达到一个分离

这是第一种方式

第二种方式

我通过用极端的pH

或者高浓度的一些变性剂

使得柱材和蛋白质同时发生形变

从而导致蛋白质和柱材之间的分离

如图二所示

而这种方法的一个缺点

显而易见的就是

我加入高浓度的去垢剂或者是变性剂

或者是极端的pH的作用下

可能会导致蛋白质的变性

因此我们没法获得活性的蛋白质

从而第三四种方法

就更适合目前在活性状态下

蛋白质的纯化

那么三四种方法

本身都是一个竞争性的反应

只不过它们竞争的对象不同

大家可以看一下

第三种方法里面

我采用的方式是加入橙色的物质

这个物质可以特征性的

去结合我的柱材

从而通过竞争的手段

把我的目标蛋白从柱材上的竞争下来

而在第4种方法里面

加入的橙色的物质

可以特征性的结合我这个蛋白质

因此它也可以通过竞争的手段

使蛋白质跟柱材之间分离开

因此三四种方法

虽然竞争的对象不一样

但是它们本质上

都是通过一种竞争的效果

将蛋白质和柱材达到一个分离的效果

在这里我们列出一些

在亲和层析中

一些典型的生物分子作用

包括抗原和抗体之间的相互作用

酶和底物substrate

或者是底物类似物

Substrate analogue或者是抑制剂

以及辅因子之间的相互作用

还有两条互补的核酸链

之间的相互作用

以及色素或者是激素与激素的受体

之间的相互作用

这些都是非常典型的

我们可以在亲和层析中

利用的相互作用

但是在今天这节课中

我重点介绍其中的两种

最常用的在亲和层析中

可能用到的相互作用

一种是谷胱甘肽

与谷胱甘肽硫转移酶之间的相互作用

而谷胱甘肽硫转移酶

缩写成GST

另一种是利用金属离子

与多聚的组氨酸标签之间的相互作用

下面我们分别来看

首先这是组氨酸标签

蛋白质纯化的一个基本原理

组氨酸的侧链是一个咪唑基团

研究表明

组氨酸的侧链咪唑基团

可以与镍离子之间形成一个螯合作用

从而结合在镍离子上面

因此我们可以准备好层析的介质

上面偶联上镍离子

之后让带有组氨酸的标签的蛋白

通过这个介质

蛋白就会以组氨酸标签的侧链

结合在镍离子上面

从而挂在柱材上面

那么如何进行这种蛋白质的洗脱呢

我们要用到的一种小分子

如左下角所示叫做咪唑

大家可以看到咪唑

与组氨酸的咪唑基团极为相似

因此我们在使用高浓度的咪唑来处理

这个挂上了组氨酸标签蛋白的柱材之后

高浓度的咪唑

可以和组氨酸标签的蛋白之间

形成一个竞争作用

那么当咪唑浓度足够高的话

它可以竞争掉目标的蛋白质

从而结合到了镍离子上面

而目标蛋白

达到了和镍离子的一个分离

被洗脱了下来

这个就是组氨酸标签

蛋白质纯化的一个基本的思路和流程

那么对于这种纯化最常用的载体

在真正的实验过程当中用到的载体

是pET系列的载体

在这一系列里的多个载体当中

载体上已经编码好了组氨酸的标签

我们可以很方便的

将我们的目的基因

克隆在如图黑颜色的区域里边

就可以让我的目标基因

带上组氨酸标签

这个组氨酸标签或者加在氮端

或者加在碳端

可以方便的选择

接下来介绍一下

GST标签的蛋白质的纯化

前面已经介绍了

GST是谷胱甘肽硫转移酶的一个

三字母的缩写

那么顾名思义

谷胱甘肽硫转移酶

可以催化的底物就是谷胱甘肽分子

因此在这种标签的

蛋白质纯化的过程当中

我们会将柱材上面

偶联上谷胱甘肽的分子

那么带有GST

或者说谷胱甘肽硫转移酶

这个标签的蛋白质

接触到这个柱材之后

谷胱甘肽硫转移酶就会特征性的

结合住柱材上面的谷胱甘肽的分子

从而达到特异性的结合这样的一个效果

那么之后如何进行洗脱呢

我们还是通过竞争的方式

加入高浓度的谷胱甘肽分子

这一次高浓度的谷胱甘肽分子

可以竞争性的去结合

谷胱甘肽硫转移酶标签的蛋白质

从而使得GST标签的蛋白

与柱材之间达到一个分离

这也就是我们前面介绍的

GST标签蛋白质纯化

和组氨酸标签蛋白质的纯化

它们同样都是利用了竞争的原理

但是只不过竞争的对象是不一样的

那么常用的用来表达

带有GST标签的蛋白质的载体

是pGEX系列载体

在这一个系列载体当中

在启动子的

接下来的一段序列

载体上已经放有了

谷胱甘肽硫转移酶对应的基因序列

因此在这个载体表达蛋白的时候

我们可以将我们的目标基因序列

放在谷胱甘肽硫转移酶的下游

从而表达出一个融合蛋白质

这个融合蛋白质就包含了

谷胱甘肽硫转移酶即GST的标签

而GST的标签和目标蛋白之间

是以肽键的形式进行连接的

这就是表达GST标签常用的载体

同时我们在真实的实验中

可能也不用上述这种方式去纯化

而我们会通过

将谷胱甘肽的标签

带谷胱甘肽标签的蛋白质

结合在柱材上之后

大家可以看到

在这个里面还具有一个

PreScission Protease这样的一个

蛋白酶的酶切位点

那么这个蛋白酶的酶切位点表明

PreScission Protease

可以去特征性的识别酶切位点

并在这个酶切位点的内部

进行一次切割

在进行这次切割之后

目标蛋白和GST标签就达到了分离

这样目标蛋白就可以很容易的

从柱材上面分离下来

这个就是谷胱甘肽硫转移酶的

方式的标签

来进行蛋白质纯化的一个基本的原理

好 我们今天这一节就介绍到这里