答辩陈述在线视频

大家早上好

欢迎大家今天来到

左腾和江力玮的博士答辩会

我是张绮

是张林琦老师的博士后

今天代替史老师来担任

这个答辩秘书的工作

首先我们请答辩委员会主席

陈应华老师来宣读

答辩委员会的成员名单

并且宣布这个答辩会正式开始

下面我公布一下

这次答辩委员会的组成

这个梁米芳研究员

是中国疾病与预防控制中心

病毒学预防控制所

何玉先研究员

中国医学科学院

病原生物学研究所

王新泉教授

清华大学医学院

谭旭研究员

清华大学医学院

再我本人

清华大学生命科学学院

下面我们开始

首先让导师介绍

这个研究生的基本情况

这个今天答辩的第一位

按照上面来的是江力玮

江力玮同学

首先导师介绍江力玮同学的

基本情况

我叫张林琦

是江力玮的博士生导师

首先欢迎各位评委

在百忙之中抽出时间

来参加江力玮的博士论文答辩

首先呢我想介绍一下

她的情况

江力玮同学是1987年5月

生于安徽省合肥市

2005年毕业于咱们

南方医科大学临床医学专业

并获得学士学位

2010年9月直博生

进入我的实验室

在过去的五年学习期间呢

江力玮同学学习努力

完成了所有的课程

以及通过了博士生的资格审查

也发表了相关的论文

在外审的三位评委的评语之中

对于江力玮的论文的

创新性理论意义实用价值

以及在其中反映出的理论水平

和专业知识

还有写作水平

和博士学位论文的学术水平

均给了全优

今天呢进行博士论文答辩

介绍完毕

好 谢谢张老师

下面请博士生

江力玮同学报告她

博士论文的主要内容

时间是30到45分钟

各位老师和同学大家上午好

我叫江力玮

是清华大学医学院2010级直博生

我的导师是张林琦教授

我博士阶段研究的主要课题是

针对中东呼吸综合症冠状病毒

中和抗体的筛选及机制研究

2002年重症急性呼吸综合症

SARS在整个东南亚地区

甚至全球引起爆发

持续大约两年的时间

该疾病主要就是

由SARS冠状病毒引起的

在当时感染者超过了8000人

死亡率高达10%左右

SARS在人群中的传播

主要是通过人和人之间的接触

进行传播

当时这一事件提示着我们

动物来源的冠状病毒

对人类有着潜在的威胁

在人身上可以引起

严重的疾病和爆发流行

10年之后2012年

又有一种新型的冠状病毒

首先在中东地区被发现

它引起的急性呼吸系统的症状

与SARS当时非常的相似

我们将这种新型的冠状病毒

称为中东呼吸综合症冠状病毒

简称为MERS

目前该疾病已经由中东地区

传播到欧洲东南亚

以及最近疫情非常严重的

韩国地区

到截止到6月6号为止

该疾病的感染人数

已经达到了1185例

死亡率接近40%

远高于10年前SARS的10%

现在韩国的疫情

还在不断的持续当中

新发病例不断的发生

MERS在人群中的传播

也主要是通过

人和人之间的接触传播

但是这种传播只是小范围的

是非常有限的

目前还没有证据证明

它会像当年的SARS一样

进行大范围的扩散

对于这种死亡率高达40%的

新型的冠状病毒

目前我们迫切的需要

有效的疫苗

以及治疗手段

来预防和控制疫情

结合本实验室的研究优势

和研究方向

我们提出了我们的目的

是分离

针对MERS的人源的

单克隆中和抗体

为了达到这个目的

首先我们需要

对MERS冠状病毒本身

进行深入的了解

和其他的冠状病毒非常类似

MERS冠状病毒

也是一个单股正链的

RNA病毒

包膜上主要包括三种蛋白

S蛋白 E蛋白和M蛋白

S蛋白是与受体相互作用

可以介导病毒进入宿主细胞

而E蛋白比较小

是嵌合在病毒的包膜之中

M蛋白是一个跨膜转运的蛋白

它主要和病毒的出芽

以及整个病毒包膜的形成有关系

而在病毒的内部

主要就是病毒的核蛋白

和RNA的复合物

前面我们已经提到

MERS冠状病毒

是利用S蛋白与受体结合

从而介导病毒与宿主

发生膜融合

S蛋白是以三聚体的形式

存在于病毒表面

包括S1和S2两部分

S1蛋白可与受体相互作用

相互作用之后

它从S2蛋白上脱离

从而暴露了这个疏水性的

FP的结构域

随后FP的结构域

插入到宿主细胞膜上

形成了这样一种膜融合的

中间的过渡状态

随后HR1和HR2两部分相互靠近

形成了一个大的结构域

随着这个过程的进行

将病毒的膜和宿主的膜

相互拉进

最后完成了整个膜融合的过程

虽然目前关于MERS冠状病毒

膜融合过程中的细节

并没有完全清除

但是MERS冠状病毒

它膜蛋白的组成和

以及膜融合大致的过程

和其他的冠状病毒

是非常类似的

所以如果能有抗体

抑制S1蛋白和受体结合

或者是抑制膜融合过程中

这些构象的改变

这些抗体就具有中和活性

所以我们的目的

也就是分离到

这一类的中和抗体

2013年初一个荷兰的研究组

首先鉴定了MERS病状病毒的

细胞受体是人源二肽基肽酶4

简称为DPP4

又称为CD26分子

那么冠状病毒是如何

识别这个受体的呢

2013年7月清华大学生科院的

王新泉老师实验室

和中科院微生物所

高福老师实验室

几乎同时鉴定了MERS表面

S蛋白的受体结合域

是S1蛋白上的367位氨基酸

到606位氨基酸

同时他们还解析了

这个RBD与DPP4复合物的

晶体结构

这两项研究详细的阐明了

MERS冠状病毒

是如何利用RBD来识别

受体DPP4的

同时这两项研究

也给了我们一个非常重要的提示

就是RBD是一个非常重要的

中和靶点

如果能有抗体可以阻断

RBD与受体的相互作用

那么这个抗体

就可以在病毒感染的第一步

起到一个抗病毒的活性

所以我们选择RBD

作为一个抗原

来筛选我们的中和抗体

为了分离到人源的中和抗体

首先我们解决了第一个

关于抗原的问题

那么紧接着

我们面临的第二个问题

如何来分离这些中和抗体

目前分离人员的中和抗体

主要包括以下四种技术

B细胞永生化技术

展示技术

转基因小鼠技术

以及从病人的B细胞内

直接扩增抗体的技术

目前最常用的

主要包括的是展示技术

和单个B细胞的技术

当然如果我们能从

MERS感染者的B细胞内

直接扩增到抗体

这当然是非常理想的选择

但是基于生物安全

以及样品采集的难易程度来看

目前这种方案并不可行

所以结合本实验室的优势

我们选择采用酵母展示技术

来进行人源单克隆抗体的分离

本实验室所保存的酵母展示的

抗体文库

是来源于58个正常人的B细胞

我们从B细胞里

扩增出抗体的重链和轻链的

可变区

通过随机配对之后

构建在酵母表达载体上

这张图所显示的

就是酵母表面展示的

是抗体的可变区scFv

并且C端带有了一个

可检测其表达的

cmyc标签

我们就用这样一个

酵母展示的抗体库

继续进行我们的研究

我们的研究主要包括三个部分

第一部分是分离和鉴定

针对MERS冠状病毒的中和抗体

第二部分是对抗体进行优化

第三部分是构建双特异性的抗体

首先我们从第一部分

分离和鉴定这些抗体开始

前面我们已经提到

我们是利用RBD蛋白

作为抗原

从酵母展示的抗体文库中

筛选单克隆抗体

其基本原理是左图所示这样

我们将带有标记的RBD蛋白

与库容量为10的九次方的

抗体库孵育

然后通过双荧光的分选

得到与RBD特意结合的

酵母scFv单克隆

整个分选过程

包括两轮的MACS分选

和两轮的FACS分选

从这张图我们可以看出

经过两轮的MACS分选之后

酵母阳性克隆百分比

大约为0.77左右

然后再经过两轮的流式分选

这群细胞得到明显的富集

阳性率已经达到了24.72%左右

随后我们将这一群阳性细胞

分选出来

经过测序和分析

我们最后得到了14个

与RBD蛋白

可以特异性反应的酵母单克隆

这14个单克隆

与RBD结合的能力

在流式水平上

会表现出有强有弱的区别

这张表显示的是

这14个单克隆抗体的序列分析

这里边包括

他们所属的胚系

以及他们和胚系基因相比

突变率的变化

我们知道我们这个抗体库

是来源于正常人的B细胞

所以从图中我们大致可以看出

它们的与胚系的突变率

相对较保守

都在90%以上

我们拿到了这14个

识别MERS RBD的单克隆抗体

首先我们最关心的第一个问题是

它们是否具有中和活性

于是呢

我们将他们重链的可变区

重链和轻链的可变区

分别扩增出来

然后利用左图所示的

这样一种线性表达的方式

将轻链

将重链和轻链的可变区

与恒定区

以及真核表达的启动子融合

形成了一种

这样抗体线性表达载体

然后我们将这个线性表达载体

重链轻链配对

转染细胞

收取了细胞上清之后

直接进行中和抗体的

中和活性的初筛

这张右图所示的

就是中和活性初筛的结果

通过假病毒实验

我们可以发现

在这14个抗体当中

有3个抗体表现出了中和活性

分别是MERS-4 MERS-27

和MERS-36

为了精确的比较

这三个抗体的中和活性的强弱

以及精确的计算出

它们中和的IC50

我们将这三个抗体表达纯化

精确定量之后

首先还是进行假病毒的中和实验

左图所示的

就是假病毒中和实验的结果

我们可以发现

这三个抗体在假病毒的水平均

IC50均达到了纳摩尔级别

同时MERS-4抗体

它的IC50是最好的

能达到0.37个纳摩尔

另外两个抗体分别是

MERS-27是63.95个纳摩尔

而MERS-36是112.4个纳摩尔

在香港大学的协助之下

我们同时在活病毒水平

检测了这三个抗体的中和活性

活病毒的结果

如这张图所示

基本趋势与假病毒是相同的

MERS-4抗体是最好的

MERS-27其次

而MERS-36是中和活性最弱的

我们知道病毒感染细胞

除了游离的病毒颗粒

可以直接进入细胞之外

还有另外一种更加有效的方式

是病毒在细胞和细胞之间的

直接转移

这种转移主要是通过

细胞和细胞的融合而实现

所以为了验证我们的抗体

是否有阻断这一过程的功能

我们将COS7细胞

分别转染病毒的膜蛋白

和受体基因

随后将这两种细胞混合

他们之间会发生细胞的融合

形成这种合胞体

当我们把抗体加入之后

结果如右图所示

MERS-4抗体可以完全的阻断

这样一个过程

在显微镜下观察

与阴性对照差不多

而另外两种抗体

虽然也有阻断效应的功能

但是远远不及4号抗体

仍然可以观察到

部分合胞体的形成

以上的中和实验

以及这个合胞体的实验

都是在细胞的水平

验证了这三个抗体的中和活性

那么我们接下来想知道

它们发挥这些功能的分子机制

是什么

由于我们的这三个抗体

是用RBD蛋白作为抗原

筛选得到的

所以我们首先推测

它们发挥中和作用的机制

是通过阻断病毒与受体的

相互作用而实现的

于是我们将标记之后的

RBD蛋白

与表达DPP4受体的细胞

共16：40

通过流式我们可以检测到

它们之间的结合

如下图这种

这个橙线所示

是RBD与DPP4结合之后

所以检测到的

当我们把抗体加入到

这个反应体系中

我们可以看到

随着抗体浓度的增加

MERS-4抗体阻断它们俩结合的效应

是逐渐增强的

并且在最高浓度

330个纳摩尔的时候

MERS-4抗体

可以完全的阻断

它们两个的相互作用

而MERS-27抗体这种阻断效应

相对较弱

在最高溶度的时候也有

也只有中等程度的阻断

而MERS-36抗体阻断效应

则非常微弱

可以说几乎观察不到

阻断效应的存在

这个阻断效应的强弱

与抗体的中和活性是基本吻合的

但是MERS-36抗体

它的阻断效应如此微弱

可是它却具有中和活性

所以我们推测

可能它除了阻断病毒与受体

相互作用之外

还存在其他的中和机制

既然抗体可以与受体

竞争结合RBD

那么在亲和力方面

这些抗体是否也有优势呢

我们通过SPR实验发现

MERS-4抗体与RBD的亲和力

比受体与RBD的亲和力

高大约45倍左右

而MERS-27号与RBD的亲和力

与受体在同一个数量级

但是我们意外的发现

中和活性最差的

MERS-36号抗体

它的亲和力是三个抗体当中

最好的

能够达到6.32乘以

10的负10次方的级别

我们知道一个抗体

要发挥很好的功能

除了与亲和力有关系外

还有另外一个非常重要的因素

就是它识别的表位

所以为了回答这个问题

我们继续进行抗体

识别表位的分析

王新泉老师实验室

在解析受体与RBD复合物的

晶体结构中

鉴定出了14个RBD上的

氨基酸位点

这些位点是RBD与受体

相互作用的关键位点

我们将这14个突变体

包装成假病毒

进行中和实验

经过分析中和实验中

IC50的变化

我们将它总结于这张表

我们可以发现其中有三个点

455 513和542

对MERS-4抗体的中和活性

影响较大

而另外有四个点

455 506 510和513

对MERS-36抗体中和活性影响较大

但是这些点都没有发现

对MERS-27抗体的中和活性

有影响

很有可能这个抗体

识别的表位

不在这个相互作用的平面上

我们将对MERS-4和MERS-36

抗体影响较大的几个点

在RBD蛋白上标示出来

这些点可能就是抗体识别的

RBD上的区域

从图中我们可以看出

MERS-4识别的区域

与DPP4和RBD相互作用的区域

有很大程度的重叠

所以这结果

从表位方面解释了

为什么MERS-4抗体

能完全的阻断受体与病毒

相互作用

而MERS-36抗体识别的位置

明显的发生了偏移

它并不在这个DPP4

与RBD相互作用的平面

而在这个边缘的位置

所以MERS-36的亲和力最高

但是它的中和活性却是最差的

主要是因为它识别的表位

有偏差

虽然在假病毒的中和实验中

我们没能鉴定出

针对MERS-27抗体有影响的

关键的氨基酸位点

但是我们与王新泉老师实验室的

俞小娟同学合作

成功的解析了MERS-27

与RBD的复合物的晶体结构

如左图所示

从这个晶体结构中

我们可以看出MERS-27

识别的表位

主要是位于DPP4与RBD

相互作用平面的后方

所以它的中和机制

也主要是通过阻断DPP4

与RBD的相互作用

但是由于它的角度有偏差

所以它不能完全阻断

这种相互作用

它的中和活性

要比MERS-4抗体较弱

在这个结构中

我们同时还鉴定了MERS-27识别的

关键的氨基酸位点

是535 536和539三个点

我们通过假病毒的侵染实验

证明了这三个点对假病毒

进入细胞也是有非常大的影响

同时又通过假病毒中和实验

证明了这三个点

的确是对27号抗体

完全的不敏感

是属于27号抗体的逃逸株

通过点突变的实验

我们大致确定了MERS-4抗体

识别的表位

就是图中这个橙色所标示的

同样通过结构生物学的分析

我们解析了MERS-27号抗体

识别的表位

我们换一个角度来观察

会发现MERS-27号抗体

识别的表位

与MERS-4号识别的表位

是两个

是RBD上两个不同的区域

所以基于这样一个发现

我们将这两个抗体联合在一起

做假病毒的中和实验

结果如这张图所示

当我们联合使用

两种抗体的时候

它们可以表现出轻微的协同效应

并且这种协同效应

随着抗体浓度的增加

而逐渐减弱

这一发现对将来抗体临床的应用

具有非常重要的指导意义

我们分离的三个中和抗体

主要是识别MERS的RBD

所以我们将目前已经分离的

病毒株的RBD序列

做了个对比

发现具有很高的保守性

说明目前病毒在这一区域的突变

是比较低

这一特征有利于我们的抗体

将来适用于不同的临床病毒株

在这一部分的工作中

主要就是利用MERS RBD蛋白

作为抗原

筛选到了三株中和抗体

分别是MERS-4 MERS-27

和MERS-36

通过机制研究我们发现

它们主要是通过

阻断病毒与受体的相互作用

而发挥抗病毒效应

当然还有另外一个抗体

MERS-36

我们并没有完全研究清楚

它为什么在阻断效应

如此微弱的情况下

仍然具有中和

同时通过表位的分析

我们发现两个最好的抗体

MERS-4和MERS-27

是识别RBD上不同的区域

当我们联合使用这两种抗体

它们在假病毒的水平

可以表现出轻微的协同效应

在第一部分的工作中

我们通过突变假病毒的中和实验

大致确定了中和活性最好的

MERS-4抗体的识别表位

但是我们更希望

能够通过结构生物学的手段

来精确的解析它的表位

目前MERS-4抗体有一个很重要的

很重要的影响因素

就是它的表达量

低于抗体的表达的平均水平

这一个缺陷

不利于结构生物学的研究

以及将来的临床应用

所以为了能继续后续的研究

我们首先要解决

这个抗体表达量的问题

于是就有了第二部分工作

对MERS-4抗体进行优化

我们知道抗体是由

重链和轻链组成

首先我们第一个要解决的问题

就是要知道

它表达量的低

是由于重链导致的

还是由于轻链导致的

我们将MERS-4的轻链

与另外一个表达量很高的

抗体的轻链进行互换

得到了两种嵌合体

我们发现互换之后的

MERS-4抗体它的表达量

依然很低

而另外一个表达量高的抗体

仍然表达着高表达这一个特性

所以我们觉得轻链对表达量

几乎没有影响

我们将目标锁定在

MERS-4抗体的重链上

MERS-4抗体的重链的可变区

与以下这些抗体

都来源于同一个胚系

这些抗体他们表达量

都非常高

我们将MERS-4抗体

可变区的序列

与这些抗体进行比对

是为了进一步找到

重链上限制表达量的精确的区域

从这张比对结果中

我们可以看出

4号抗体与其他这些抗体

区别最大的就是三个CDR区

一二三

而另外三个

另外四个FR区

它们则相对保守

于是我们选择与MERS-4

最相近的19号抗体

进行CDR区域的置换实验

我们依次将MERS-4抗体的

CDR1 2 3

分别置换到19号抗体上

形成了一二三

三种嵌合体

随后我们对这些嵌合体

进行表达量的分析发现

CDR1和2对表达量的影响

非常微弱

与原始的19号抗体差不多

但是当CDR3一旦置换到

19号抗体上

我们发现表达量的变化

非常的显著

同时这些嵌合体中

也只有原始的4号抗体

可以与RBD结合

其余的都不能与RBD结合

为了进一步确认以上这个结果

我们同时进行了多个区域的置换

同样是发现仅仅有CDR1和2

置换到19号抗体上

表达量的影响非常微弱

但是当CDR3加进去之后

表达量的影响则非常显著

所以我们基本上确定了

影响MERS-4表达量的因素

主要是重链的CDR3的区域

于是接下来我们就利用

分子定向进化的方法

针对这个区域

进行抗体表达量的优化

首先第一步我们要构建

MERS-4 SFV酵母定点随机

突变文库

我们通过随机引物2

将突变位点

定位于重链的CDR3区域

MERS-4抗体的重链CDR3区域

非常有特点

它只有五个氨基酸

所以我们在构建完成之后

通过测序发现

这一区域的突变率比较好

同时库容量能达到

10的6次方左右

满足我们筛选的需求

随后我们用生物素标记之后的

RBD蛋白

对这个突变库进行筛选

筛选过程总共经过了两轮的

流式分选

结果如这张图所述

上图显示的是

第一轮流逝分选的结果

我们为了能筛选到高表达

以及亲和力增高的突变体

于是我们将RBD筛选的浓度

由原来筛库的100个纳摩尔

降低到50个纳摩尔

在第一轮中显示出

它的阳性率为1.7%左右

随后我们对分选的这群细胞

随机挑取了20个克隆

进行测序

我们发现一个不好的现象

就是在第一轮测序结果中

野生型的MERS-4的氨基酸序列

占到了20条中的12条

约60%左右

所以针对这样一个情况

我们在第二轮分选中

改变了分选策略

是为了尽量减少筛选出

这些野生型的序列

我们将分选的门上移

尽量筛选强阳性的酵母群

第二轮的阳性率

大约为4.7%左右

第二轮分析完之后

我们随机挑取了50个克隆

进行测序

在这50个克隆里边

只有两个野生型的抗体序列

已经比第一轮野生型序列

野生型序列所占的比例

明显的减少

其余的48个序列里边

有重复

最后经过分析

我们得到了17个突变体

我们将这17个突变体

进行单克隆的验证

结果是这张图所显示的

为了对比出这些突变体

与野生型的差别

我们进一步将RBD的浓度

降低到25个纳摩尔

从图中这些验证的结果

我们可以看出

几乎所有的突变体

与RBD结合之后的荧光强度

都比野生型要强

所以我们开始猜测

这种荧光强度变强

可能有两个方面的原因

第一是每个突变体的表达量增加

于是它在每一个

酵母细胞表面的个数增加

随之观察到的

就是荧光强度的增加

第二个因素

有可能是突变体的亲和力增加

也会导致这种荧光强度的变强

或者是两个因素都有

所以接下来我们要从这两个方面

继续分析这17个突变体的特性

我们将这17个scFv的突变体

全部构建成全长的抗体

与MERS-4轻链配对

转染细胞之后

收取了上清

直接进行初筛和鉴定

结果如这张图所示

在上图显示的是

抗体表达量的鉴定

我们发现这些突变体

它们的表达量

都比野生型的抗体要高

绝大多数是有非常显著的变化

而有一些

只是有微弱的提高

下图显示的是突变体

与RBD结合的情况

我们发现有九个突变体

依然保持了很好的结合活性

分别是1 4 7 17 20

22 23 26和30

所以综合这两方面的因素考虑

我们将继续对这九个突变体

进行表达纯化

进行精确的中和实验

以及亲和力的测定

左图所显示的是

九个突变体的假病毒

中和实验结果

我们可以发现

这些突变体的中和活性

与野生型相比

有微弱的提高

或者是与野生型相近

集中中和活性最好的

两个突变体

分别是4号和30号突变体

它们的中和IC50

比野生型的抗体

大约低了3.6倍和6倍左右

同时我们将这九个突变体

进行精确的亲和力的测定

从这张表中我们可以看出

大多数的突变体

与野生型的突变体是

与野生型的MERS-4抗体

是在同一个数量级

有三个突变体

1 4和30

它们的亲和力KD值

大约可以达到10的负10次方

所以综合这两个结果

我们发现4号突变体

和30号突变体

既是中和活性最好的

也是亲和力最好的

所以它们与野生型相比

是最优的两个抗体

而在上一张抗体表达定量的

结果中

我们可以看到

4号突变体的表达量

明显的比30号突变体要高

于是我们将这两个抗体

大量的表达纯化发现

在实际生产抗体的过程中

这个4号的突变体

它的表达量比野生型的抗体

提高了10到11倍左右

而30号的突变体

仅仅比野生型提高了1.5倍左右

所以综合所有方面因素考虑

4号突变体是我们最想要的

最理想的优化后的抗体

它既保持了亲和力中和活性

并且在表达量方面

有了大幅度的提高

提高了10到11倍

所以后续我们将针对这个突变体

继续进行结构生物学的研究

以及其他的分析

前面实验结果已经证明了

4号抗体和27号抗体

是识别RBD上不同的区域

所以我们推测

如果把这两个抗体

做成双特异性的抗体

可能在中和活性

和广谱性方面

都会有更好的表现

但是由于之前4号原始的抗体

它的表达量非常低

所以双特异性抗体

一直没能鉴定成功

但是随后我们筛选到了一个

表达量提高十倍的突变体

于是我们继续拿这个突变体

与27号构建成双特异性的抗体

我们构建了两种双特异性的抗体

一种是将4号突变体的scFv

连接在27号抗体的全长上

我们将这种抗体称为

4scFv-27

另外一种是将两者颠倒

将27号的scFv

连接在4号抗体的全长上

称为27scFv-4

随后我们将这两种

双特异性的抗体

与4号的突变体

以及27号抗体

进行假病毒的中和实验

从结果中我们可以看出

这两个双特异性的抗体

与4号突变体的中和活性相差不大

但是它们的中和活性

明显的强于27号的抗体

IC50大约相差了180倍左右

与之前的实验结果基本是一致的

这两个抗体融合

这两个抗体融合表达之后

并没有相互影响

但是我们发现它们的中和活性

与四号突变体相比

也没有较大程度的提高

可能是由于4号这个抗体

它本身的中和活性比较强

再加上一个相对较弱的中和抗体

所以提高的幅度

不是非常的明显

同时亲和力的测定结果也表明

双特异性的抗体与4号

与4号突变体的亲和力

大致相当

但是略有提高

仍然处于同一个数量级

但是它们与27号亲和力相比

分别提高了270倍和137倍

变化非常的显著

随后我们继续分析

我们在广谱性方面的变化

在之前的MERS-27

和RBD复合物的结构中

我们鉴定了两个蛋白相互作用的

三个关键的氨基酸位点

分别是535 536和539

这三个点的突变假病毒

对MERS-27抗体是完全不敏感的

于是我们拿

这两个双特异性的抗体

继续进行假病毒中和实验

结果是这张图所显示的

我们发现双特异性抗体

对535 536和539均能保持有

较高的中和活性

但是这三个突变体

对27号抗体

都是完全不敏感的

但是对于不同的突变株

这两个双特异性抗体的

IC50之间会略有差异

这一结果说明了

双特异性抗体的广谱性

与原始的27号抗体相比

有了较大幅度的提高

虽然目前我们只通过结构生物学

鉴定了对MERS-27抗体

完全逃逸的3个突变株

我们还没有找到针对4号抗体

完全逃逸的突变株

但是随后通过结构生物学的

继续分析

我们相信会找到这些关键点

而且我们也推测

这两个双特异性的抗体

对这样一些点

也同样会具有中和活性

在将来MERS冠状病毒

复制进化的过程中

如果这些点发生了突变

原始的抗体不能对它保持中和

那么双特异性抗体

也会成为很好的补充

在这一部分的工作中

主要包括两个方面

通过分子定向进化的方法

对MERS-4抗体的表达量

进行优化

我们成功的筛选到了一个突变体

它与原始的抗体相比

表达量提高了10倍左右

同时我们将这个突变体

与27号抗体

构建成双特异性的抗体

它可以中和对27号抗体

完全逃逸的突变株

在广谱性方面

得到了明显的提高

在背景介绍中

我们提到了目前我们迫切的需要

有效的疫苗和治疗手段

来预防和控制MERS的疫情

于是我们就分离了中和抗体

那么中和抗体对疫苗

对疾病的控制

又会起到怎样的作用呢

在本研究中

我们已经通过大量的体外实验

证明了我们分离到的

这些抗体的有效性

那么下一步研究

需要用动物模型

继续进行体内的相关评估

我们可以将MERS-4的突变体

MERS-27

以及双特异性的抗体

在体外进行大量的表达纯化

随后在人源化的小鼠

以及恒河猴体内

进行动物保护实验

同时评估我们的抗体

对已经感染的个体

是否具有治疗效果

或者是对尚未感染的个体

是否具有预防感染的作用

在动物体内评估了

它们的有效性和安全性之后

当然我们最终的目的

是希望能够推向临床

为疫情严重的MERS感染者

提供一条快速有效的

特异性的治疗途径

目前MERS在韩国的疫情非常严重

新发的感染

每天都在不断的增加

中和抗体对高危人群的保护

同样是一个

我们需要

急需要解决的问题

所以面对这一现状

我们正在积极的进行动物实验

为将来的临床应用

做充分的准备

对于人群持续性的保护

疫苗是另外一个

非常有效的手段

中和抗体的分离

对疫苗的设计

同样是具有指导意义

目前已经有研究小组

用RBD蛋白作为抗原免疫小鼠

能够在小鼠体内

诱导出中和抗体

但是我们从我们的筛选结果

可以看出

我们筛选到了14个

可以与RBD结合的抗体

仅仅只有3个抗体

具有中和活性

说明在RBD蛋白上

还有很多非中和的表位

这些非中和表位区域的存在

对于这个蛋白

在体内诱导中和抗体

其实是不利的因素

所以我们从受体与RBD

相互作用的这个结构可以看出

真正与受体相互作用的RBD上

是四个beta折叠

以及周围loop形成的

这样一个平面

同时我们通过对我们抗体

识别表位的分析也发现

我们的抗体基本上

都是位于这个平面

其中最好的4号抗体

与这个平面有非常大

非常大程度的重合

所以我们想如果

我们拿另外一个支架型的蛋白

与这样一个所谓的表位疫苗

进行融合表达

通过这样一种修饰

再将这个RBD蛋白去免疫

可以它会在体内诱导更强的

中和抗体

同时我们还可以采取

另外一种策略

将RBD蛋白上

一些非中和表位

通过糖封闭的形式

将它们进行封闭

只暴露我们想要的这个区域

这样经过修饰的一个RBD蛋白

再去免疫小鼠

可能会比之前

这个原始的RBD蛋白

诱导出更强的中和抗体的反应

最后感谢我的导师张林琦教授

五年以来对我的悉心指导

以及我们合作的王新泉教授

在课题上给予的帮助

还有实验室的史宣玲老师

在各个方面的指导

还有香港大学的郑博健教授

和袁国勇教授

在活毒方面

给予的支持

以及四川大学华西医学院

武永康老师

对于自身抗体检测实验的支持

还有实验室其他的同学

以及已经毕业的师姐

当然还要感谢在座的各位老师

能够在百忙之中抽出时间

参加我的毕业答辩

谢谢大家