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大家好，我是Philippe Glaser
在巴斯德研究院工作

在本课中
我将介绍

如何运用基因组学方法
来预测抗生素耐药性

以及通过计算机完成抗菌谱

传统上在临床实验室中进行的

是表型测试

以确定某一菌株的耐药性
或敏感性

比如，通过在皮氏培养皿上
对某种抗生素进行琼脂扩散

但对于促进抗生素耐药性的基因

和突变的知识

让我们得以开展分子测试

这种测试基于聚合酶链
反应扩增和测序

然而
随着新测序技术的出现

随着测序成本的降低

如今已经可能
运用全基因组测序

来预测某种细菌菌株的

耐药性和敏感性

我们想要识别出的
既是抗生素耐药基因

也是促进菌株产生耐药性的突变

耐药基因由可动遗传因子携带

它们编码将改变抗生素

改变靶点或输出药剂的蛋白

然而紧密相连的蛋白
可能具有不同的特异性

于是可能出现不同的表达水平

也就是说
对于耐药性表现型的预测

并不是简单的

基因组的突变瞄准
抗生素的靶点

比如对利福平来说的rpoB

针对氟喹诺酮耐药性的gyrA
和parC

也有一些突变会导致
主动外排系统的超表达

或降低渗透性

染色体的其他地方也有

可能促进耐药性的突变

这些突变就更难被识别了

大致而言，一个基于基因组的
抗菌谱工作流程

会从一个生物取样开始
比如尿液或细菌

以便进行DNA抽取

如果是在DNA浓度低的情况下

也有可能进行全基因组扩增

基于这个DNA
一个基因文库建立起来

并在一个自动测序仪上
被测序

一台自动测序仪的输出
被我们称作FASTQ文件

它是一个包含短序列
和大量序列数的文件

其中有个生物信息学步骤
用来分析所有的测序reads

以及预测耐药性

我们最终想要的是
一份提供给临床医师的报告

这样他们就能选择抗生素

或者被用于分子流行病学研究

所以
如果我们抱有一些乐观精神

那么所有这些都能在
不到一天的时间内完成

虽然成本依然非常高

并且需要临床实验室中的

DNA测序器材

如今这还非常少见

一个关键步骤是数据分析

测序仪输出的是FASTQ文件

有两种办法来识别
抗生素耐药基因

和促进耐药性的突变

第一种是进行全新序列组装

以获得一个基因组序列草稿

然后寻找抗生素耐药（AMR）
基因和突变

比如通过BLAST相似性搜索

为此
我们会运用数据库

有几个数据库
能在互联网上进入

或者也可能建立
我们自己的抗生素耐药基因

和突变的数据库

第二种办法也相似

从FASTQ文件开始着手

我们能直接在数据库中的序列上
将reads比对到基因图上

以便识别出基因和突变

当我们了解到菌株上的
抗生素耐药基因

我们就需要确定它们的耐药水平

为此也有不同的手段

可以是从基因和突变识别中来
的直接预测

我们有一个基因
我们可以假定它将引发耐药性

在如结核分枝杆菌一类的细菌中

耐药性只源于基因突变

我们能在点突变和耐药表现型

之间进行某种基因相关性研究

因此我们需要识别出

将会导致耐药性的点突变

还有一些更为复杂的手段

我将不会深入细节

比如

有序回归能让我们预测出

与导致耐药性的多种基因标记
相关联的表现型

或者 多元线性回归模型

不仅能预测其耐药还是敏感

还能预测耐药水平和
最小抑菌浓度

这已经在淋病奈瑟氏菌中
得到应用

为此
我们需要估测

在敏感度方面
这种预测有何价值

被正确识别出的耐药表现型

占有多大比重

以及特异性
这与敏感表现型是一样的

最终
存在两种类型的错误：

一个公认的严重错误是

一些被假设为敏感的菌种

事实上是耐药的

容许值非常低
这类错误中不到1.5%

因为它可能会产生巨大影响

因为细菌被预测是敏感的

但事实上却是耐药的
因此不会对抗生素产生反应

在这种严重错误的情形下

这些是被预测为耐药的细菌
但事实上却是敏感的

因此我们将不会使用

也许可能在这种感染的情况下
有效的抗生素

这应当低于3%

我想要描述的第一个理念

是一项关于大肠杆菌和
克雷白氏杆菌菌株的研究

这些菌株对不同的抗生素耐药

74个大肠杆菌菌株和
69个克雷白氏杆菌菌株

它们被测试了属于
3种不同族类的

7种不同抗生素的耐药性

内酰胺类、氟喹诺酮类
和氨基糖甙类

敏感性通过液基稀释法
一式两份被测试

如果在两个测定中存在差异

则会进行一个Etest来
确认耐药性或敏感性

gyrA和parC中的突变
被探测出来

有对氟喹诺酮类的耐药性

如你所能观察到的

严重错误的比率
在这种分析中极低

在大肠杆菌的情况下只有0.3%

而在克雷白氏杆菌的情况下

只略高于1.5%的限度

因此几乎是可以接受的

严重错误的比率也低于3%

这显示出，事实上
基于全基因组测序

有可能预测出菌株的表现型

第二个例子
针对的是结核分枝杆菌

结核分枝杆菌是一种
生长极其缓慢的细菌

也就是说需要花很长时间
来获得抗菌谱

因此全基因组测序就可能
是一种有价值的替代选择

该研究建立在对

大量菌株排序的基础上
共3651个

所有这些菌株都表现出

对高达11种抗生素的药物敏感

随后作者在23个候选基因中

寻找与抗生素耐药性相关联
的突变

他们还在其他的染色体上
寻找可能导致了

菌株耐药性的突变

通关寻找同型突变的方法

同型突变指的是

在某些菌株中单独出现的突变

因此对这种突变来说
有非常强的正向选择

而抗生素将会有
强烈的正向选择效果

因此同型突变可能与
抗生素耐药性相关

第一步是识别出

有可能与耐药性表现型
相关联的突变

为此
他们比较了基因组

和被视作训练数据集的
2099个基因组的表现型

这样
他们就识别出120种

可能与耐药性相关的

以及可能是耐药性表现型
原因所在的突变

接下来的步骤是

在剩下的1552个菌株上
确认这些预测

在这些菌株中

作者们基于这些突变的存在

来预测耐药性表现型

他们与从传统方法中

得出的表现型的结果做了对比

他们观察到

他们能在92%的案例中
预测出耐药性

更重要的是

他们能在98%的案例中
预测出敏感性

因此这意味着全基因组测序

在预测结核分枝杆菌菌株
的敏感性上非常有效

因此也对选择抗生素治疗方案
十分有效

总结一下
全基因组测序是一种

预测抗生素耐药性或敏感性
的有效方法

当然，我们需要做
额外的研究来完善准确度

并让我们识别出新的抗性标记

此外，全基因组测序
还将提供补充信息

比如种类鉴定或
致病性基因的存在

我们需要更多的自动化设备
用于菌落培养

获得全基因组测序和预测

以及降低反应时间

我们还将需要指导方针

我还应该说

全基因组测序如今

对抗生素耐药性分子流行病学
而言是个重要工具

我感谢大家对本课的关注

我希望你能意识到

在抗生素耐药性领域中

运用全基因组测序的全部可能性