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中东呼吸综合症冠状病毒中和抗体的筛选及机制研究

博士研究生:江力玮

指导教师:张林琦 教授

所属院系:医学院

论文摘要

中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory Syndrome coronavirus，MERS-CoV）是2012年分离的新型冠状病毒，该病毒在人类引起严重的呼吸系统的症状甚至造成死亡。目前还没有针对该病毒特异性的治疗药物和手段。MERS-CoV感染宿主细胞是通过病毒表面膜蛋白的受体结合域（RBD）与细胞表面的受体二肽基肽酶4（DPP4）相互作用而实现。

本研究利用生物素标记的RBD蛋白为钓饵，从正常人的抗体库中分选得到了3个具有中和活性的抗体MERS-4、MERS-27和MERS-36，并通过间接ELISA实验以及中和实验，精确地鉴定了它们的功能，三个抗体对MERS-CoV假病毒和活病毒的中和IC50均在纳摩尔级别。通过机制研究发现，三个中和抗体主要是通过阻断DPP4受体与RBD相互作用而发挥功能的，同时MERS-4通过阻断病毒与受体相互作用还可以抑制病毒通过细胞和细胞融合的途径进行传播。亲和力的测定以及假病毒中和实验表明，MERS-4之所以有高效的中和活性，是因为与RBD的亲和力比RBD与DPP4的亲和力高45倍，同时识别的抗原表位与DPP4结合的位置有很大程度的重叠。MERS-27和 MERS-36分别在亲和力和识别表位方面有偏差，所以中和活性与MERS-4相比较弱。我们与生命科学学院王新泉老师实验室合作，利用结构生物学的方法解析了MERS-27与RBD复合物的晶体结构，综合之前的突变假病毒中和实验分析，MERS-4和MER-27识别RBD上不同的区域，于是我们联合使用两种抗体在假病毒水平表现出相互协同的作用。我们用区域置换和分子定向进化的方法优化MERS-4抗体的表达量，筛选到的MERS-4突变体Second-4，保持了原始抗体的亲和力和中和活性，且表达量提高了10倍左右。将经过表达量优化的Second-4和MERS-27构建成双特异性抗体，通过中和实验、亲和力的检测以及广谱性的分析发现，双特异性抗体不仅具有高效的中和活性和结合活性，同时还能够中和对MERS-27完全逃逸的假病毒突变株，在广谱性方面得到了显著的提高。

以上结果表明，MERS-4、 MER-27和MERS-36是针对MERS-CoV特异性的高强度的抑制剂，将来可以有望成为MERS-CoV感染的治疗和预防的有效手段。