02-1-细胞微观探秘在线视频

大家好

从今天开始我们来一起学习

细胞研究基本方法

所谓工欲善其事 必先利其器

细胞生物学作为一门典型的实验学科

即发展始终离不开研究技术与方法的创新

发展和应用

要想探究细胞社会的奥秘

首先就需要能看清楚细胞

和细胞内部的世界

细胞那么小 我想看清楚

但我们的肉眼一般只能分辨

0.2毫米的物体

如图中所示

借助光学显微镜

能分辨0.2微米

利用电子显微镜

甚至能分辨0.2纳米的物体和结构

因此 显微镜和显微技术

便成为细胞研究中不可或缺的技术

今天我们就一起来了解

如何借助显微镜技术

观察细胞社会的微观奥秘

显微镜林林总总

主要类型包括

普通光学显微镜

荧光显微镜

激光扫描共聚焦显微镜

还有超分辨荧光显微镜

以及电子显微镜

我们先看一下

普通光学显微镜

这类显微镜就是利用光学的原理

把肉眼所不能分辨的微小物体放大成像

以便观察细微结构这样的光学仪器

17世纪光学显微镜的发明

使人们第一次看见了细胞

进而建立了细胞学说

为细胞学的兴起和发展奠定了基础

随着光学显微技术和图像技术的快速发展

光学显微镜在细胞研究中

展现出新的活力

图中所示是我们细胞实验中最为常用的

光学复式倒置显微镜

它的结构主要有三部分组成

第一个部分是光学放大系统

第二部分是它的照明系统

第三部分是机械和支架系统

当然了还可以连接一些附属设备

比如像CDC成像

还有计算机等进行图片的获取和分析

那对显微镜来说

最重要的性能是要看得清楚

即高分辨率

这个分辨率是指区分两个点之间

最小的距离

那么分辨率的高低取决于光源波长

阿贝推算出光学显微镜分辨率的极限

大约是可见光波长的一半

可见光中波长最短的是蓝紫光

它的波长大约在0.4微米左右

因此普通光学显微镜的最大分别率

是0.2微米

这就是我们通常所说的阿贝极限

光学显微镜可以直接用于观察

单细胞生物或体外培养细胞

那么如果想观察

这个生物组织样本当中的细胞

这常常需要对想观察的材料

进行固定、进行包埋

然后切片 然后进行染色

然后才能用显微镜观察

那么如图中所示

就是常用的这个苏木精 伊红染色

简称H E颜色

之后的这个组织切片显微图像

图中能够清晰的看到

这个染成蓝紫色的细胞核

和染成红色的细胞质

除常用的普通复式光学显微镜之外

根据实验研究的需要

人们还设计了多种其他类型的

光学显微镜

如暗视野显微镜

紫外光显微镜

红外光显微镜

相差显微镜和干涉显微镜等等

其中相差显微镜和干涉显微镜

充分利用了活细胞这个相位的变化

可导致光干涉现象

实现对非染色活细胞的观察

发明人德国物理学家泽尼克

因此而获得了1953年诺贝尔奖

显微技术具有里程碑意义的创新

是将这个荧光标记技术

与显微镜技术完美相结合

而诞生的一类荧光显微镜

而荧光显微镜技术是目前在光镜水平

对细胞结构和特定生物大分子进行

定性定量定位研究的最有力的工具

俺荧光显微镜技术主要是用于检测

物体上的特异的荧光

与普通光学显微镜不同的是

这个荧光显微镜增加了两套这个滤光片

如图所示

它的第一套滤光片称之为激发滤光片

装在这个光源跟这个样品之间

只有那些能激发荧光物质

发出荧光的这个特定波长的光才能通过

那么第二套称为阻断滤片

就是装在我们的这个目镜和物镜之间

只让观察物体所发出的荧光通过

这个图中还显示了常用的

这个常用染料的激发光波长

和它所发荧光的波长

荧光显微镜的这个暗视野

为荧光信号提供了强烈的反差效果

还只要有微弱的荧光都能很容易被观察到

如图中显示

细胞分裂中期

这个纺锤体的微管呈绿色荧光

而染色体本身呈蓝色荧光

那么纤维蛋白被标记成红色荧光

从而能够观察多组分

多个细胞器在细胞当中的存在状态

那么荧光显微技术除显微镜部分之外

其核心技术是荧光标记技术

常用的荧光标记技术包括以下几种

第一个就是我们用荧光素直接标记

如染色体多色荧光标记探针

利用这个探针

是目前进行染色体核型分析的主要方法

那么第二种标记称为是免疫荧光标记

主要是利用荧光抗体

进行细胞免疫荧光染色

从而对细胞中的蛋白质表达水平

和它的分布进行观察

那么第三类标记技术称为

荧光蛋白重组标记

其中以绿色荧光蛋白简称GFP

与目标蛋白重组融合表达

进行活细胞的实时标记为典型代表

那么可以对细胞蛋白质这个表达的动态

和功能进行研究

借助越来越多的荧光探针

特异性更好的荧光抗体

和更加简便的这个重组荧光蛋白表达系统

那么荧光显微镜已成为我们探究细胞

微观奥秘的主要手段

在荧光显微镜技术基础之上

加装一套这个激光共聚焦成像系统

就诞生了更加强大的

激光扫描共聚焦荧光显微镜

简称共聚焦显微镜LSCM

或者是口语称为共聚焦

就是confocal

LSCM极大的提高了图像的分辨率

目前共聚焦显微镜在研究亚细胞结构

与组分的定位及动态变化等方面的应用

越来越广泛

用激光共聚焦显微镜可清晰观察到

这些细胞骨架的成分和细胞核的位置

和它们之间的相互关系

得益于激光共聚焦强大的功能

那么荧光共振能量转移技术

荧光光漂白恢复技术

以及单分子成像技术等

才能够相聚建立起来

关于这个光学显微镜的分辨率制约

探索细胞社会微观奥运的脚步

长期停滞在微米尺度

但科学家们始终没有放弃

对亲眼看到细胞内活的分子

是如何工作的这一极致的追求

直到最近超分辨率荧光显微镜技术

或称纳米显微技术的出现

才真正让我们可以进入亚细胞结构

细胞器和生物大分子的纳米观测水平

2014年诺贝尔化学奖授予了

埃里克·白兹格、斯特凡·赫尔

和威廉姆·莫尔纳尔三位科学家

以表彰他们在超分辨荧光显微镜领域

做出的突出成就

值得一提的是华人科学家

像庄小威教授在此领域

也做出了卓越的贡献

光学显微镜直到最近才突破

200纳米的阿贝极限

但早在上世纪30年代

电子显微镜或简称电镜 EM

早已实现50纳米的分辨率

并经过随后50年的完善

相继研制了透射电子显微镜 简称TEM

扫描电子显微镜 简称SEM

和扫描隧道显微镜 简称STM

如今 电子显微镜的分辨率可达0.2nm

也就是在原子水平

但是这对样本的制备有极高的要求

为了配合电镜技术

已经发展了许多制样技术

主要包括

像超薄切片器、负染色技术

还有冷冻蚀刻技术

以及三维重构与低温电镜技术

还有像二氧化碳临界点干燥

以及表面处理等具体方法等等

尽管电子显微技术啊

分辨率远远高于光学显微镜

但是至今 电子显微镜还不能用于

观察活的生物样本

因此需要把光学显微镜和电子显微镜二者

结合起来研究细胞的微观奥秘

简单总结一下

我们人眼能看清0.2毫米的头发丝

那么普通光学显微镜让我们看到了

0.2微米的这个细胞世界

超分辨率荧光显微镜

把我们带进细胞内的超微结构

和生物大分子的这个网络之中

而电子显微镜则给了我们认识分子

和原子的构成模样

相信人类对细胞的微观探秘之旅不会停止

正朝着更微观的单分子水平

和更接近活体生命活动的

实时动态过程迈进

下一讲 我们学习细胞研究的

另一大基本技术 细胞培养

同学们再见