2.2.3 蛋白质电泳与免疫印迹（下）在线视频

下面为大家讲解蛋白质免疫印迹

免疫印迹

是指将蛋白样品转移到固相载体上

而后利用相应的抗体

来检测目的蛋白的一种方法

这种方法

可以用于鉴定目的蛋白是否存在

蛋白的分子量大小

含量多少等

目前常用的固相载体

有硝酸纤维素膜和PVDF膜两种

硝酸纤维素膜也就是NC膜

是蛋白质免疫印迹标准固相支持物

在低离子转移缓冲液的环境下

大多数带负电荷的蛋白质

会与膜发生疏水作用

而结合在膜上

不需要预先活化

对蛋白质的活性影响小

非特异性本底显色浅

价格低廉

使用方便

PVDF膜

与蛋白质亲和力高

用前需在甲醇中浸泡

以活化膜上的正电基团

使其更容易与带负电荷蛋白结合

其中NC膜需要根据转移蛋白的大小

选择膜的孔径

随着膜孔径的不断减小

膜对低分子量蛋白的结合就越牢固

通常用0.45

和0.22两种规格的NC膜

其中

大于20KD的蛋白

可用0.45微米NC膜

小于20KD

大于10KD的蛋白

可选用0.22微米

如若目的蛋白小于10KD

也可以选择0.1微米的NC膜

蛋白质免疫印迹的大体流程是

首先将蛋白质样本

通过SDS-PAGE分离

然后将凝胶放置于一定的电场中

在贴着凝胶的正极方向

摆放NC膜或是PVDF膜

此时

由于蛋白质结合了大量的SDS

在电场的作用下会向正极移动

然后以非共价键形式吸附到膜上

此时蛋白质已吸附到膜上

不管是NC膜还是PVDF膜

都有吸附蛋白质的特性

因此需要

将膜上其它位点封闭

不然会有非常高的背景

和非特异性吸附

然后

通过特定的标签

或者是通过自身特定的氨基酸序列

膜上的蛋白质可以与特定的抗体结合

此时的抗体被称为一抗

结合在蛋白质上的一抗

也可以成为抗原

结合二抗

这里的二抗

通常是结合在一抗的Fc区域

成为一种通用抗体

并且二抗通常标记有

特定的基团可以用于检测

实验室中常用的是辣根过氧化物酶

简称HRP

也有用碱性磷酸酶

同时随着技术的发展

目前也出现了荧光基团标记的二抗

提高了灵敏度和发光信号的稳定性

如果是HRP标记的二抗

我们加入底物显色以后

可以检测电泳分离的

特异性目的基因表达的蛋白成分

下面我以一个具体的例子

来讲述如何使用蛋白质免疫印迹的方法

来摸索最适的表达条件

我们选取的目的蛋白

是利用杆状病毒

在昆虫细胞里表达的蛋白B

蛋白B在构建的时候

为了便于纯化

在C端加入了6个组氨酸构成的His标签

理论分子量是96KD

在杆状病毒扩毒的过程中

可以选用噬斑滴定法测定病毒滴度

但是因为操作周期长

我们往往选用检测目的蛋白的方式

来指示病毒的滴度

考虑到此时目的蛋白的表达量比较低

还有昆虫细胞分泌的其它蛋白的干扰

为了提高灵敏度和特异性

我们选用蛋白质免疫印迹

用anti-His标签的抗体

来检测目的蛋白

实验样品

是加入不同浓度P2代杆状病毒的

SF9昆虫细胞

阴性对照是SF9细胞培养的上清

阳性对照我们选用

带有同样标签的

MERS-CoV 冠状病毒spike蛋白

我们选用的一抗是anti-His的小鼠IgG

二抗是HRP标记的抗小鼠IgG的驴抗

操作中我们主要使用的机器

是电源和转印设备

这里只介绍湿转操作

准备与胶大小相当的NC膜与滤纸

浸泡到转移buffer当中

打开转膜夹具

将灰色一面放到托盘的底部

依次放上海绵

三层滤纸

NC膜

与跑好的SDS-PAGE胶

膜的上面再放上三层滤纸

与海绵

用模具进行除气

夹上转印夹具

将灰色一面朝向有刻度线的一面

将托盘中的buffer倒入转膜槽中

将转膜buffer线

补齐到max与min之间

盖上电源盖

红色对应灰色一端

黑色与黑色对齐

打开电源装置

这里面我们选用恒流

首先将电压调到最大

我们的目的蛋白是90KD左右

所以我们在恒流的时候设定

它的电流是300mA

时间是1小时

我们接通电源线

在运行之前

我们将电泳槽放置在

冰水混合物当中

用来冷却降温

放置好后

我们点击Run按钮开始运行

这里我们看到它的电流稳定到300mA

转模结束之后

取出转模槽

断开电源线

打开电源盖

用工具取出转膜夹具

放到瓷盘中

打开转模夹具

剥离三层滤纸

此时我们可以看到

蛋白已经完全转至NC膜上

SDS-PAGE上没有残余的蛋白

将膜放到预先准备好的buffer当中

样品经过SDS-PAGE的分离

转移至NC膜上

样品转移到NC膜上之后

由于NC对蛋白质具有高吸附性

抗体也是蛋白质

所以我们需要用封闭液

将多余的蛋白质结合位点进行封闭

在与一抗孵育

此时

膜上有一些通过抗原抗体相互作用

而结合在膜上的抗体

但是同时也有一些非特异性吸附的抗体

需要用带有吐温20的缓冲液洗膜

在与二抗孵育

同样需要用吐温20洗膜

现在可以进行显影操作了

下面我们将膜

加到样品托盘上

取等体积的A液与B液

这里面我们取750μL的A

与750μL的B液

上下吹打混匀

将混好的反应液

均匀的加到膜上

转动托盘

让反应液均匀的在膜上分布

然后将托盘加到样品舱里

我们选择自动曝光模式

点击Start开始

从这个结果我们看到

在95KD与130KD之间有一条阳性条带

这与目的蛋白B的理论分子量是相符的

而且还带有His标签

基本可以确定是我们的目的蛋白

加入不同浓度的P2代杆状病毒

目的蛋白的表达量呈现梯度变化

随着加入量的提高

从200μL到500μL

蛋白质的表达不断提高

但是加入P2代病毒过多

比如600μL时

大量的杆状病毒感染SF9细胞

导致细胞还没有来得及合成

和释放子代病毒

就被杀死了

因而表现出了目的蛋白的表达量

降低的情况

因此我们选用500μL的接毒量

进行后续实验

在了解了基本的原理

操作流程

试验方法之后

我们在具体的实验中

可能还会遇到一些实际问题

比如这张Western-blot结果图

从图中我们可以判断

目的蛋白是有表达的

而且也会随着时间的变化出现梯度变化

接种的病毒量

也会对蛋白的表达量有影响

但是这一结果的背景很高

整张膜呈现灰色的状态

考虑可能有几个方面的原因

第一

NC膜

可能膜不干净

可以尝试更换一张干净的膜

第二

可能封闭不充分

可以考虑更换封闭液

如果同时操作多张膜

也要避免多张膜的叠加

如果用脱脂牛奶封闭

考虑是否是奶粉没有充分溶解

第三

在抗体的孵育中

一抗二抗的浓度可能不合适

可以考虑降低抗体的浓度

再重复这个实验

另外也可能是曝光时间过长

可尝试缩短曝光时间

第四

操作过程中也要维持膜的湿润

否则也容易出现背景高的问题

另一方面

也可能出现像这张图一样

几乎没有条带的曝光结果

而且这一实验结果

也凸显了一个比较常见的

实验设计的巨大缺陷

就是没有设置阳性对照

因此我们无法判断

是样品本身没有目的条带

还是Western-blot实验操作中出现了问题

而出现了这样的结果

因此任何实验

大家一定要设置合适的

阳性对照与阴性对照

针对这一实验结果

Western-blot本身可能存在几个问题

第一膜的使用

如果选择NC膜

要考虑膜的孔径选择是否合适

如果目的蛋白分子量较小

使用孔径0.2微米

或0.1微米的NC膜

以防止蛋白在转膜的过程当中穿过了膜

第二

一抗二抗的选择是否合适

如果是针对标签的抗体

要考虑蛋白质的三维结构

是否会将N端或者C端的标签包裹住

使得抗体不能有效地识别标签

使用的二抗是否可以识别一抗

另外

也要考虑一抗二抗的浓度是否合适

第三

洗膜的条件是否合适

是否存在洗膜过度的情况

可降低洗膜条件

第四

显影液是否正常

其中发光液的B液是否工作

显色与曝光时间是否合适

可考虑延长曝光时间

最后为大家介绍几种常见的

其他鉴定蛋白质的方法

除了常见的电泳与免疫印迹之外

质谱也是常用的蛋白质鉴定手段之一

质谱是样品在离子源内电离

产生的各种离子

经过质量分析器按其质荷比 (m/z) 分离

并依次被检测器检测并记录下来

形成按顺序记录各种质荷比（m/z）

离子相对丰度的谱图

可以用来分析蛋白质的分子量

通过肽段鉴定蛋白质

对翻译后修饰的具体位点

进行分析和鉴定

以及生物标志物的筛选

相互作用研究

质谱成像等等

在实际操作中

经过SDS-PAGE分离的蛋白质

只需要将感兴趣的条带切下来

就可进行肽段分析

从而根据特定的序列鉴定蛋白

实验过程中

我们往往也会遇到纯化出来的蛋白质

在SDS-PAGE之后

目的条带下出现一条较小的条带

在Western-blot中

加入抗标签的抗体

也能检测出阳性信号

这时我们就要考虑

蛋白是否存在降解的情况

例如

图中的蛋白C

我们在它的C端加入了His标签

分子筛纯化后

发现目的蛋白下方出现一条较小的条带

Western-blot中

加入anti-His抗体

可同时检测出这2条带

将SDS-PAGE分开的这2条带切下来

进行质谱鉴定

发现都含有目的序列的特定肽段

这提示我们

蛋白C

可能在N端的某一个肽键

容易断裂

留下了较大的C端

所以加入C端的His标签的抗体

仍能检测到小条带的蛋白

这种情况下

我们可以通过N端测序

确定较小条带N端第一个氨基酸

从而确定蛋白质断裂的位置

蛋白质纯化后

也涉及到对其功能的检测

由于不同的蛋白质生物学特性不同

所用的功能检测手段可能千差万别

这里只简单介绍两种

比较常见的方法

一种就是酶活检测

例如

流感病毒表达的NA

也就是神经氨酸酶又称唾液酸酶

可以水解唾液酸

经过纯化

获得NA蛋白分子之后

我们可以使用唾液酸的类似物

4-MUNANA

NA的唾液酸酶活性

可将这一底物水解成两部分

一个是alpha-D-N-唾液酸

另一部分是4-甲基伞形酮

其中4-甲基伞形酮是一种荧光基团

激发波长是365nm

发射波长是450nm

因此可通过检测450nm的光信号

确定被水解的底物的量

从而对指示NA的唾液酸酶水解活性

如图所示

纯化的NA

具有水解4-MUNANA的活性

除了对酶活性的检测以外

对于配体

或受体明确的蛋白质

还可以通过检测纯化的蛋白

与相应的受体或配体的结合

从而显示纯化的目的蛋白

是否具有正常的生理的功能和活性

同样以流感病毒蛋白为例

流感病毒编码血凝素HA

HA通过结合

alpha-2 3连接的唾液酸受体

或是alpha-2 6连接的唾液酸受体

吸附宿主细胞

发生感染

因此纯化获得的HA的重要功能

就是结合不同的唾液酸

利用SPR技术

发现纯化的安徽H7N9编码的HA

可以同时结合两种唾液酸

也验证了纯化的HA

维持了其原有的生物学功能

可用于进一步的结构和功能研究

总结本节课程

我主要讲解了实验室中

最常用的2种技术

SDS-PAGE与Western-blot

分别介绍了实验原理

并通过2个实例

讲解2种技术的

实验流程和常见问题

同时对质谱

N端测序在蛋白质研究中的应用作了简单介绍

最后通过NA的酶活性检测

和HA与受体结合的功能分析

进一步鉴定纯化后蛋白质的生物活性

希望通过我的讲解

大家已经掌握了2种关键技术

并且预祝大家在今后的学习和科研生涯中

平安顺遂