3.8 病毒在线视频

大家好 我是王祥喜

来自中国科学院生物物理研究所

今天我讲的内容是

病毒纯化方法与应用

首先介绍一下什么是病毒

病毒是一类个体微小 结构简单

必须在活细胞内

寄生的非细胞生物型生物

其颗粒大小从几纳米到几百纳米不等

且形态各异

有的规则的正二十面体

有的是无固定形态的球形颗粒

有的是子弹形

有的是砖块形

与细菌相比

病毒的体型非常小

且结构非常简单

病毒性传染病

严重着威胁着人类和动物的健康

每隔几年就会爆发一些局部性

甚至大规模的传染性疾病

让我们记忆犹深的2003年SARS非典的爆发

2008年安徽阜阳手足口EV71的爆发

2012年中东呼吸综合征MERS病毒的爆发

以及2014年非洲埃博拉病毒疫情

2016年南美寨卡疫情

以及最近在我国肆虐各个省份的非洲猪瘟疫情

这些都是由病毒所引起

对人类健康

经济造成了极大的损失

我讲的内容主要包含以下三个部分

第一是病毒的培养

第二是病毒纯化

第三是高纯度病毒的实际应用

所谓病毒培养

就是病毒的扩增

主要有以下三种方式

第一 是将病毒接种于易感染的动物体内

使其在动物体内进行复制 扩增

最常见的动物模型是小鼠

例如 早些年

将日本乙型脑炎病毒接种于

小鼠脑部进行扩增和传代

我国老一代科学家正利用了

病毒在动物体内

连续多次传代的特性

进行了几百次传代

最终获得了减毒株

应用于减毒活疫苗的开发

也拯救了无数的生命

第二种方式是用鸡胚细胞进行扩增

如现在的流感病毒的生产过程

很多就是使用鸡胚细胞进行扩增的

第三点 也是最常用的

是用细胞培养的方式

当今大多数病毒性的疫苗的生产

都是使用这个细胞培养的技术

使用动物细胞培养来扩增病毒

又主要分为两类

第一类是原代细胞的培养

所谓原代细胞就是指

从动物的器官组织中分离

在合适的条件下进行扩增

但通常来讲

原代细胞只能传5至10次

其传代次数非常有限

第二种是最常用的

是用细胞株或者是用纯化细胞系进行培养

这类细胞在合适的情况下

可以进行数十次的传代

乃至永生化的传代

绝大多数的疫苗

采用的是有限

代数的细胞株

进行生产

细胞培养的方式

有实验室级别的瓶皿

细胞方瓶

也有工业生产上常使用的细胞工厂

和细胞反应器微载体技术

进行几百升

乃至上吨细胞的培养 进行扩增病毒

一些病毒在细胞中复制

能够引发细胞形态上

结构上的病变特征

又称为CPE

细胞病变

细胞病变可以在一定程度上

能够反映病毒的复制过程

可用于监测病毒的扩增

当然

病毒的扩增效率与细胞状态

起始接种浓度

培养基

以及培养条件等多种因素相关

病毒接种量需要测定病毒的滴度

测定病毒滴度的方法

常用的有噬斑法 也有TCID50法

简单的来讲

病毒的培养包括

健康细胞的前期准备

病毒种子的准备和滴度测定

按照MOI=0.1-5

进行接种病毒

然后进行细胞培养2-7天

在细胞发生90%以上的细胞病变后

再进行收获培养基及细胞

最后进行灭活处理

常用的灭活剂有甲醛

或者是β-丙内酯

病毒颗粒往往不是一种颗粒

在天然的培养过程中

病毒颗粒存在着

包含基因组的成熟颗粒

包含基因组的成熟颗粒

也有不包含基因组的空心颗粒

有的病毒

甚至还有脱衣壳中间体等

不同状态的颗粒

然而培养条件

在一定程度上能够影响着不同颗粒之间的比例

接下来我们了解一下病毒纯化的策略

所谓纯化就是

病毒颗粒的有效富集

杂质逐渐去除的过程

首先是病毒收获液的澄清

过滤等处理

病毒纯化策略又可分为

初步纯化和精细纯化两个环节

初步纯化有常用的四种方式

第一种

收获液洗滤 浓缩

第二种

Capto Core 700吸附

第三种

是差速离心

第四种

是沉淀法

精细纯化

主要包括密度梯度离心

和层析法

接下来我会

逐一讲述

病毒纯化的每一种方法

洗滤 浓缩通常是病毒纯化的第一步

可以采用截留值为100 kDa

300 kDa

甚至是1000 kDa的膜包

或中空纤维柱子

进行浓缩和洗滤

在浓缩的同时用缓冲液进行洗滤

能够有效的去除

分子量为几百KD以内的小蛋白的杂质

同时Capto Core 700

也是一种高效去除小蛋白的一种方式

差速离心是实验室级别

一种常用的纯化手段

其基本原理是利用了

病毒与杂质之间

沉降系数的差异

通过离心的方式

进行有效的区分

举个例子

模式图中绿色的代表病毒颗粒

这个蓝色的代表大的杂质

黑色的代表小的蛋白

首先是用大的离心力

100000g进行较长时间的离心1-3个小时

将病毒颗粒和大的杂质都通通的离心到离心管的底部

然后弃上清

去除小蛋白的杂质

然后将病毒颗粒与大杂质进行重悬

在合适的转速和离心力的条件下

将大杂质离心到底部

而保持了病毒颗粒留在溶液当中

此时保留上清

弃沉淀

最后再用高速将病毒颗粒离心至底部

富集了病毒粒子

沉淀法是实验室级别和工业级别

均常使用的纯化方法

其原理是在高浓度下

中性盐或者是PEG多聚物存在下

病毒或蛋白质在溶液中

溶解度降低而产生沉淀

其中硫酸铵和PEG

是最常用的沉淀剂

举个例子

随着硫酸铵浓度的升高

上清总蛋白相对浓度在逐渐降低

然而病毒粒子

在硫酸铵的沉淀浓度

和很多杂蛋白在

硫酸铵的沉淀浓度是有差异的

可以通过

30%和55%

两步沉淀法进行有效的纯化病毒颗粒

密度梯度离心

是最常见的

病毒纯化的策略之一

其原理是用一定的介质如蔗糖

在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度

然后将病毒的粗纯物置于这样的介质的顶部

通过离心力的作用下

将病毒颗粒粗提物进行分层

和纯化病毒颗粒

右图是采用的

非连续密度梯度纯化HCV病毒的一个案例

连续密度梯度

是实验室级别经常使用的

精细纯化病毒的一种方式之一

现在有全自动的密度梯度混合仪

在几分钟之内可以

配好连续的密度梯度

这大大减少了纯化的时间

也提高了纯化的精度

举一个简单的例子

是我们实验室采用

连续的蔗糖密度梯度的方法

进行纯化EV71的例子

我们使用15%-45%

连续的蔗糖密度梯度离心分离EV71病毒粒子

能够分离得到两条带

上面的那条带沉降系数是比较低的

是空心颗粒

下面的那条带

是含有基因组的成熟病毒粒子

其沉降系数是非常大的

这两种颗粒

在电镜照片上

我们也能够看出

一个是空心的一个是实心的

而且这两种颗粒

结构特征以及免疫保护性

具有明显的差异

分子筛是纯化蛋白

和纯化病毒颗粒常用的方法之一

其利用了病毒颗粒

与杂蛋白在尺寸上的差异

进行有效的分离

如狂犬病毒疫苗

就是采用分子筛进行精细纯化

离子交换也是纯化蛋白

和病毒颗粒常用的方法之一

其利用了病毒粒子

与杂质蛋白表面电荷性质上的差异

进行有效的分离纯化

流感病毒疫苗等

是使用了离子交换柱

进行最后一步的纯化

因为该步不仅能够高效的纯化病毒粒子

还能够高效的清除

宿主细胞的核酸残留

病毒纯化是否有效

需要一定的质量控制方法去评估

其包括蛋白质电泳SDS-PAGE

去评估蛋白的纯度

比如EV71空心颗粒和实心颗粒

这四条带 VP1 VP2 VP3 VP4

第二种是用分析超离或动态光散射

去评估颗粒的均一性

如这个80s的沉降系数是空心颗粒

160s的沉降系数是实心颗粒

第三种是用负染电镜

去观察形态和纯度的均一性

纯化的病毒颗粒有什么用呢

首先这个病毒颗粒可以用于基础性研究

用于结构生物学的研究

这张PPT展示了

近三年来我们实验室

使用冷冻电镜技术

解析的多种病毒颗粒的

精细三维结构

这些结构信息能够为

靶向药物的设计

和新型疫苗的设计提供了理论基础

病毒颗粒还用于

抗体的制备 诊断试剂盒的开发

比如临床上多种传染性疾病诊断试剂盒

大多数是以病毒颗粒作为抗原

检测患者血清中的抗体

用于反映这个患者

处于感染什么时期

高纯度的病毒颗粒

也是疫苗最有效的成份之一

病毒纯化

也是疫苗纯化过程中一个重要环节

灭活型病毒疫苗

和减毒型病毒疫苗

仍是目前最主流的疫苗研发的策略

此外

病毒颗粒还广泛的应用于药物运输载体

该载体能够

提高药物的靶向性

降低药物的毒副作用

病毒颗粒也是用于基因治疗载体最好的一个方式

如腺相关病毒AAV

就是一个非常好的用于基因治疗的一个载体

最后

我举一个例子

很多病毒它具有很好的融瘤效果

可以作为融瘤病毒

例如改造的单纯疱疹1型病毒

应用于黑色素瘤的治疗

而且目前已经在美国上市

最后呢 通过本节内容的学习

相信大家对病毒的纯化

病毒的应用有一定的了解

然而每一类病毒都有自己的特性

没有一种通用的策略

能够用于所有病毒的纯化

但是相信随着

新技术的发展和创新

病毒的纯化

也会变得越来越容易

最后谢谢大家