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ÄKTA pure是一台灵活和直观的

制备液相色谱系统

可以快速的制备

从微克级到克级的蛋白 多肽

和核酸等目的产物

系统由三部分组成

主要的是ÄKTA pure主机

收集器和UNICORN软件三部分

其中主机部分是高度模块化的

可根据实验需要加载相应的模块

实验中使用的缓冲液

需要放置在机器的上端

注意所有的ÄKTA使用的缓冲液

都需要经过（过滤）除气处理

液体通过入口管道

经过缓冲液入口选择阀

进入A泵与B泵

这里面我们A泵有A1 A2两个泵头

B泵有B1 B2两个泵头

在使用时

我们需要对它进行设置

A泵与B泵的液体汇集到压力表

进行压力检测

然后进入混合池

将A泵与B泵的液体进行搅拌

A泵与B泵的液体在混合后

进入进样阀

进样阀的一个端口

COL口

用于柱子的连接

将COL口的连接线

与柱子的顶部连接

柱子的底部

与紫外检测器连接

检测紫外波段

经过电导检测器进行电导率的检测

经过pH值检测器进行pH值的检测

此时

液体流至出口阀

若无样品流出

则直接进入废液缸

如果此时出现样品峰

就可以通过出口进到收集器

收集器可根据时间

体积和自动峰识别进行组分收集

样品在上样前

需要在低温情况下

经过高速离心处理

将离心后的上清转移到另一个离心管中

待用

这里需要注意的是

所有上样到ÄKTA和层析柱的样品

都需要经过高速低温离心或过滤处理

以避免堵塞柱子和机器

我们今天要介绍的是分子筛层析

这种层析方法

是根据蛋白的大小进行分离

我们首先将柱子连接到机器里

今天我们选用的柱子

是Superdex 200 increase

连接柱子之前

我们要先设定限压为1.8 MPa

流速为0.6 mL/min

接下来我们拧开柱子上端的堵头

将紫外检测池上的连接线拧开

我们看到液体在向下滴

将堵头放在柱子的上端

此时不要拧紧

我们看到慢慢的有液体

从柱子上端溢出

这时

旋紧接头

拧开

柱子下端的shipping device

将柱子放在夹子上

用连接线将柱子的底部

与紫外检测器连接

这样柱子就连接到了机器里

层析柱一般是保存在20%的乙醇当中

在我们进入我们的PBS buffer之前

我们需要将柱子当中的20%乙醇洗掉

这时需要对系统进行暂停

我们拿出A1泵放到

经过除气的去离子水当中

点击Continue然后运行洗泵程序

这里面我们在泵的选择上选择A1泵

一个柱体积之后

我们需要将A1泵头

放到缓冲液PBS当中

同样点击Pause

Continue之后运行洗A泵程序

一个柱体积之后

电导值趋于稳定

柱子就平衡好了

首先我们将一个1 mL的上样loop环

接入到进样阀的E口和F口

然后取一个10 mL的注射器

吸取10 mL的PBS缓冲液

将它推到进样阀里

取下10 mL的注射器

再取一个1 mL的注射器

吸取经过4℃

高速离心的样品

推到进样阀中

现在所有的样品

就已经在1 mL的loop环当中

在样品上到loop环之后

下面我们就开始可以上样了

但是为了保存一个完整的结果

我们可以将之前的程序终止掉

重新建立一个文件

我们需要点击Manual 运行Manual instructions

在System flow里面

我们运行它的流速是0.6 mL/min

然后文件保存到指定的目录下

这里面我们选

8MOOC这一文件夹

点击OK

将这一命令Insert到

这个命名对话框当中

同时我们还需要设定这个系统压力

选用Alarm pre column pressure

我们将压力设定到1.8 MPa

同样插到命令框里面

下一个我们可以设定的是

UV值

我们可以将这个UV值归零

同样把这个命令

Insert到命令对话框

那这时候我们就可以运行了

那这个程序就会开始

为了收集的方便

我们可以设定峰收集

根据它的UV值

进行样品收集

那么这里面有两个因素

一个就是UV值的大小

还有一个就是收集之后

每一管它的体积

峰收集

我们需要选用Peak fraction

我们给它的命令是每一管收集1 mL

同样插到命令对话框

我们起始的UV值

设定它是10 mAu

然后终止收集的UV值

也是10 mAu

这样我们将所有的命令插入到

命令对话框当中

这样我们检查一下

首先是系统的流速

然后一个重要的系统压力值

然后对UV调零

对峰收集的设定

那么这个设定就已经完成了

那我们下面点击执行

那么现在机器我们就已经设定好了

我们现在可以点击上样

执行之后我们的样品

就开始进入到我们的分子筛层析柱了

为了更形象直观的给

大家带来一个分子筛层析的过程

这里面

我们的样品选用的是带有颜色的细胞色素C

那么我们可以从这个柱子上可以看到

从这个标签的下面已经出现了这个

有颜色的粉色的样品

我们可以看到它的一个

向下走了动态的变化过程

接收到这个离心管当中的样品

我们需要进行及时的标记

然后将它放置到冰盒上

我们标记的主要信息是你的样品名

然后还有它的管号信息

这里面由于我们用到了细胞色素C

它是带有颜色的

那我们可以看到在这个管子当中

它接收的样品

就是呈现这个细胞色素C的颜色

在完成分子筛层析之后

我们需要将柱子进行收集

正常情况下

柱子需要保存在20%的乙醇当中

但是因为我们这里面在过柱子的时候

我们用的是PBS buffer

里面还有150 mM的NaCl

那20%的乙醇与150 mM NaCl相遇

有可能会有盐的析出

所以

我们再加入20%乙醇之前需要把PBS洗掉

我们首先对机器进行Pause

然后将泵A拿出

用洗瓶将泵头进行清洗

再放入经过除气的

去离子水当中

Continue之后

我们运行洗泵程序

当系统当中的电导值降低之后

就提示我们150 mM的NaCl已经洗完了

那我们就可以直接把这个水

换成20%的乙醇

让柱子充满20%的乙醇

操作上我们仍然需要

先点击Pause

因为这里面是去离子水

所以

我们不需要清洗泵头

将泵头拿出直接放到20%的乙醇里面

就可以

那我们仍然执行洗泵的程序

当我们的分子在柱子里面

充满了20%的乙醇之后

我们就可以将柱子取下来

取下来的顺序是

首先我们将柱子底部的连接线拧开

连接上我们的shipping device

这时候

shipping device是没有弹簧的

取下柱子

将shipping device的弹簧安装上

这时

我们需要将柱子顶端的连接线拧开

看到有液体从柱子顶端流下来之后

我们再将连接线

完全拿开

好

我们可以看到

现在这里已经有液体流出了

拧下连接线的连接头

拧上柱子的堵头

这样分子筛柱子

我们就已经收集好了

接下来是机器

我们拧下紫外检测池上的连接线

将进样阀

直接通过连接线与紫外检测池连接

这样机器我们也处理好了

下面我们介绍离子交换层析

今天我们使用的是阳离子柱SP Fast Flow

我们的样品是

含有BSA 溶菌酶

和细胞色素C的混合物

我们首先需要将柱子

连接到机器上

但是最一开始我们是需要

设定一个限压

点击Manual进入Execute Manual Instructions

进入Alams 这里面我们选用柱前压的设定

根据柱子的说明书

它的限压是0.3 MPa

我们输入0.3

点击执行

再设定系统的流速

我们设定1 mL/min

好

接下来

我们将柱子连接到机器上

拧开连接到紫外检测池上的连接线

这时我们可以看到有液体不断的滴出

然后拧开连接到

SP Fast Flow柱子上的堵头

我们将连接线的一端插到这个堵头里面

这时不能旋紧

我们看到液体不断的溢出

然后拧开下面的堵头

再将上面旋紧

好

再将柱子连接到紫外检测池上

这样这个柱子就连接好了

柱子

连接完成之后

我们需要更换buffer

首先

我们点击Pause

这里面我们用到两种buffer

对于离子交换层析

需要有低盐和高盐 这里面低盐

我们用的是20 mM Tris

加上20 mM NaCl pH8.0

buffer B也就是高盐buffer是20 mM Tris

加上1 M NaCl

pH同样是8.0

我们首先找出A1和B1泵

用洗瓶冲洗泵头

将它们先放到

除气的去离子水当中

之后我们点击Continue执行洗泵程序

我们需要同时清洗A泵与B泵

将柱子与系统当中20%乙醇清洗之后

我们需要更换到我们自己的buffer

点击Pause

这里面

我们需要将A1泵放到低盐buffer里面

也就是buffer A

B1泵放到高盐buffer也就是buffer B

然后执行洗泵程序

这里一定要注意我们需要进行

先清洗B1泵

B1泵清洗过后再清洗A1泵

经过五个柱体积的buffer A

离子柱就平衡好了

下面我们清洗loop环

我们拿一个10 mL的注射器

吸取10 mL的buffer A

loop环清洗好之后

我们将样品吸到1 mL的注射器里

经过进样口推到

loop环当中

好 这样样品就已经在loop环当中了

接下来我们对系统进行设置

我们首先结束之前的

处理柱子的过程

我们重新建立一个文件

点击Manual

Execute Manual Instructions

我们设定流速是1 mL/min

我们将文件储存在8MOOC

文件夹里

给文件命名 首先是日期

接下来是柱子的类型

我们的样品名称

点击OK

Insert

同样我们需要重新设定限压

柱前压选用0.3 MPa

对UV进行调零

为了方便收集

我们这里对峰收集进行设置

进入到Peak fraction

我们设置每管收集1 mL

当它的UV值到5 mAu时

开始收集

结束收集的UV值

仍然是5 mAu

我们执行命令

下面我们就可以上样了

在上样之前

我们需要在收集器预先摆好

收集管

点击Inject

在系统buffer走两到三个柱体之后

我们将Inject切回到Manual load状态

当电导值恢复到buffer A的状态时

我们可以设定梯度洗脱条件

点击Manual 进入到Execute Manual Instructions

在Pump里面

我们点击Gradient

设定

在15分钟之内

B的buffer升到50%

点击执行

我们看到这时候电导已经趋于平稳

我们设定继续提高B的百分比

也就是提高盐浓度

在5分钟之内将B提高到100%

这里我们看到当电导

已经趋向于平稳的时候

没有新的紫外吸收峰出现

那就说明我们这个离子交换层析已经完成

离子交换完成之后呢我们准备处理柱子

首先

我们需要把柱子当中的高盐buffer换成水

点击Pause

我们首先找出A1和B1泵

用洗瓶冲洗泵头

将它们先放到除气的去离子水当中

点击Continue执行洗泵程序

清洗A1泵

清洗B1泵

在去掉系统与柱子当中的盐溶液之后

我们同样

把泵放到20%的乙醇当中

我们首先是

还是点击Pause

拿出A泵与B泵

放到20%的乙醇当中

点击Continue

执行洗泵程序

在机器运行三个柱体积之后

这时候离子交换柱里面已经充满了20%的乙醇

我们可以把柱子取下来

我们首先

拧开柱子

拧上堵头 这时候 不能拧紧

然后再拧开柱子上端的连接线

这时我们看到上部慢慢的充满液体

在有液体的情况下 我们将堵头拧上

好这样 离子交换柱就已经取下了

再将连接线

与紫外检测池连接

柱子也收好了