2.2.2 蛋白质电泳与免疫印迹（中）在线视频

下面

我将根据具体的实验案例

讲解SDS-PAGE的实验操作与结果分析

本次实验的目的蛋白是蛋白A

蛋白的编码基因

已经克隆至pET21a载体中

含有目的基因的质粒

也已经转化至大肠杆菌BL21的感受态中

这一个实验的目的是通过SDS-PAGE

检测大肠杆菌是否可以表达目的蛋白

如果表达

目的蛋白是以可溶的形式表达

还是以折叠不正确的包涵体存在

首先

样品的准备

从转化的平板上挑取单克隆

在加入Amp的LB培养基中过夜活化

第二天以1比100的比例

转接至个4培养管中

每管5mL

37℃继续培养

检测菌液在600nm的OD值

大概2小时后

菌液OD会长到0.5左右

将两管菌液预冷至16℃

其余两管继续在37℃培养

两个温度的菌液各取一管

加入终浓度为0.5mM的IPTG

进行诱导

两个温度各剩余的一管继续培养

作为不诱导的阴性对照

通过离心方式收集菌体

去掉培养基

加入500μL的PBS

经过超声破碎

再通过离心

将菌体的可溶性蛋白与不溶解蛋白分开

沉淀再加入200μL的PBS

各取20μL的溶液

加入5μL的5xloading buffer

制样

下面

我们配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶

首先需要根据目的蛋白的大小

选择合适的凝胶浓度

目的蛋白A为53.2KD

参照SDS-聚丙烯酰胺凝胶的

有效分离范围

我们选择12%的丙烯酰胺浓度

进行SDS-PAGE分析

实验中我们需要使用以下试剂

这里面需要注意的是

单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺

为神经毒剂

并容易吸附于皮肤

操作时应做好防护

将混有loading buffer的蛋白样品

放到98℃干热仪上加热5分钟

为防止由于热胀冷缩

导致管口崩开

可在上面加上重物

取出样品

以最高转速离心2分钟

样品放置室温

待凝胶板制备好后上样

也可将样品保存至-20℃

但再次取出样品时

需重新加热

以便蛋白质充分结合SDS

组装制胶板

制胶板由三个部分组成

玻璃板

带凹槽的氧化铝板

垫片

组装好玻璃板之后

取出制胶模具

拧松螺丝

将组装好的玻璃板

放入制胶模具中

对称旋转螺丝

但不要拧紧

检查玻璃板底部是否对齐

垫片是否平行

对称拧紧螺丝

放回到制胶槽中

插入偏心轮

偏心轮的长端朝下

插入底部

向上旋转

燕尾夹夹至制胶板的顶部

将预先配制好的12%的凝胶

加入到制胶板中

凝胶的上层

加入1mL的水

待下层的分离胶凝固之后

我们将多余的水倒掉

用滤纸将残留的水吸干

将配好的浓缩胶

缓慢加到胶的上层

插上梳子

这样SDS-PAGE的凝胶

我们就配好了

上层胶凝固之后

我们首先取下蝴蝶夹

两边均匀的用力的拔出梳子

两边均匀用力的拧下偏心轮

取下制胶板

对角线拧松螺旋

我们将配制好的凝胶板

安装到电泳槽上

首先取下电泳槽的电源盖

将凹槽部朝向电极

两个蝴蝶夹夹紧胶板

我们取一个烧杯

将电泳缓冲液倒入烧杯中

倒入电泳槽里

外部同样加上电泳缓冲液

外部的电泳缓冲液要没过电极

缓冲液加完之后

我们就可以上样了

这里面每一个泳道我们加8μL样品

我们加入预染marker

这里面预染marker

我们可以调低它的用量

调至4μL

这样 样品上样完成

我们盖上电源盖

这里注意黑颜色对黑颜色

红颜色对红颜色

打开电泳仪的电源

这里我们选用恒压的方式

在浓缩胶部分

我们设定电压是100V

电流目前已经是最大值

时间设定15分钟

连上电源线

检查一下设置

电压100V

电流为最大值400mA

时间为15分钟

我们点击Run开始运行

我们看系统的电压在缓慢上升

稳定到100V

我们看浓缩胶

现在已经将样品压得非常好

下面我们可以调整电压到150V

时间设定到45分钟

我们检查一下150V的电压

45分钟

我们点击Run开始运行

运行结束之后

我们关掉电源

拔掉电源线

第一张胶图中

我们可以看到与未诱导的菌液相比

经过IPTG诱导的大肠杆菌

特异性蛋白表达并不明显

我们进一步将样品超声处理

分开可溶性的蛋白质

与不可溶的蛋白质

此时我们发现

在37℃的条件下

诱导的样品出现了一个特异性的条带

这一结果暗示目的蛋白A有表达

并且其表达在37℃时

主要以包涵体的形式存在

下一步

我们可以通过摸索不同的条件

这里面包括温度

诱导的IPTG浓度

诱导的时间等进一步摸索

在低温条件下

大肠杆菌是否可以表达可溶形式的蛋白A

在何种条件下

可以最大量的获得蛋白A的包涵体

这样的探索过程

均可以通过SDS-PAGE

比较不同条件下

目的蛋白条带的粗细与颜色的深浅来实现

在实际操作中

我们经常会遇到一些问题

请看对几个常见问题的分析

与可能的解决办法

老师 为什么拔掉梳子之后

上样孔变得歪歪扭扭

这里面的一个原因

就是可能你拔梳子的时候用力不均匀

另外

还有可能是胶没有凝好

过早的把梳子拨出来

导致这个上样孔歪扭

但是

这样其实有的时候是不影响使用的

比如说 我们看

对于这个凝胶壁完整的

我们可以用

上样针

将这个壁回归到原位

同时

你这里面其实还存在其他的问题

比如说 你这个上样壁断裂

那么这里面对于这个孔

我们可以考虑

加一个样品体积量小一点的

有可能就不影响它的使用了

老师 为什么我的胶条带拖尾

你的这个胶

我们需要这样看

首先看你的marker

我们看它的marker其实跑得非常好

同时还有其他的几个孔

它的上样

这个样品跑到聚集度也很好

分散的也不错

边上这几个条带出现了拖尾

那我们就要考虑

第一 我们排除了是胶的因素

因为其它有样品 还不错

那么我们自身的样品会有什么问题呢

是不是它的溶解度不好

那么我们在制样的时候

是不是要加入一些助溶剂

比如

吐温20

就有可能改善它的溶解度

然后跑出来的胶可能就会分离

分离效果就会更好

王老师 凝胶时间不对

过快过慢是怎么回事

这里面我们需要考虑影响凝胶的几个因素

如果我们加入的单体丙烯酰胺

和甲叉双丙烯酰胺的浓度是合适的话

那我们就要考虑催化剂和加强剂

催化剂

就是过硫酸铵

加强剂是TEMED

那么这两个物质

我们加的浓度是不是合适

同时

还有在不同的温度下

它的凝胶时间是不一样的

比如温度低的时候

它凝胶时间可能会延长

那么温度高的时候

可能它的凝胶时间会缩短

但总的来说

凝胶的时间大概在30分钟到1小时之间

王老师 这个样品

为什么这有这么大一团

你的这个胶

现在这样看其实存在两个问题

第一个就是你说的

有这么大一团

应该就是你上样量太多了

你看你这个孔道

已经将其他的孔道挤到边上了

还有第二个问题

就是右边这3条

它也有拖尾的现象

说明你的样品溶解度不是很好

那可以在buffer里面

加上一些助溶剂

王老师

我想问一下我的胶

上层分离的挺好

下层怎么跑得这么丑呢

你这个胶是一个典型的问题

一个非常可能的原因

就是你再配分离胶的时候

这个胶本身没有凝的特别好

然后你就把它取下来进行电泳了

那我们下次再做的时候

可以延长它的凝胶时间

然后我们再试试

可能就会改善非常多

王老师 您好

为什么我的胶跑得那么丑

而且还有点歪

你这个胶也是很典型的一个问题

我们首先看

你们的marker

本身它就已经歪了

然后同时

不同的泳道

也出现一个歪扭的现象

那这个很有可能是在你

夹胶板的时候

可能你这个胶板没有夹紧

里边的电泳缓冲液

向外渗漏

导致它的电压分布不均

出现了这种情况

SDS-PAGE中其他的常见问题

您也可以通过浏览下面的网站进行了解