4.2.2在线视频

现在我们配体固定已经结束了

后面我们将要进行

Biacore实验的第二步和第三步

分析物的结合和再生

这一步

我们将采用手动实验的模式

在软件上

我们点击Run

Run有一个Manual Run

这时候会出现一个界面

首先是选择流速

结合实验我们的流速一般是建议大于等于

20 µl/min

这里我们输入了30 µl

然后是通道的选择

我们配体是固定在4通道上

在结合实验中

我们不光要流过配体固定的通道

我们还要选择一个对照通道

所以我们选择了Flow path 3-4

在这里边有一个Reference subtraction

要选择4-3

现在我们点击Eject Rack

将样品弹出

将我们的分析物和再生液加入以后

我们就可以点击start

命名之后

实验就可以开始

在这里

我们有一个准备的60s

在等待这个60s之内

我把我们这个软件的一些命令

给大家介绍一下

这里是Flow rate是调整流速的

这是Flow path的选择

现在我们选择了3和4

你在这里面可以单独再选择

3通道或者4通道进行操作

我们进样是选择这个命令

inject command

选择样品的位置

然后选择输入需要加入的时间

这个绿色的是再生的命令

再生加样

选择和inject一样

选择位置和进样时间

这个命令是我们可以

把样品架弹出来

然后放入新的试剂

这个是Start New Cycle

当我们一部分实验做完

想做另一部分内容的时候

我们可以重新开一个New Cycle

这里可以选择流速和通道

当实验完成以后

我们可以选择这个End Manual Run

好 现在我们的实验已经开始

我们的传感曲线已经出现了

在这个结合实验里面

我们选择了3-4

所以我们会有三条线

单独的3通道的曲线

4通道的曲线

还有4-3

在这里边

我们可以通过view里面

选择曲线呈现的方式

我们可以选择只出现一条曲线

这样的话

我们点击3通道

就只出现3通道的线

4通道就是4通道的线

还有4-3的线

现在我们就要进行结合实验

在结合实验之前的这条曲线是缓冲液

流过芯片表面

共同组成的一个信号

现在加入我们的分析物

放在R1D1的位置

进样60s点击OK

这时候

进样针将会从样品架上

将我们想要进样的样品吸取

然后流过芯片表面

现在开始进样

在手动模式里刚开始进样的时候

我们的横坐标会出现一个小标志

然后在这之前

会有个baseline的取值

我们现在可以看到

现在是我们的分析物

在流过芯片

这个过程属于结合过程

当曲线开始上升的时候

说明是有结合的

在我们设置的

进样时间60s到达之后

仪器将会停止进样

自动改回缓冲液

这个时候我们反映的就是

生物分子相互作用

解离的过程

大家可以看到这个斜率

不是一个上升的信号

而是一个开始下降的信号

结合过程和解离过程的斜率

代表了相互作用的动力学

那在我们分析物结合的时候

如果分析物本身的解离比较慢

不能从配体上

完全解离

我们需要进行再生

再生的目的是将分析物

完全从配体上解离

这样方便下一次分析实验

好 我们的再生液

我们现在进入下一个再生

再生液

我放在了R1D2的位置

再生的时间一般比较短

我们这次选择20s

在界面这个下面的框里

我们的这个结合的信号

都会在这里显示出来

而我们曾经的操作

在左侧都会显示出来

在这个软件里边

有一个小工具叫Reference Line

这个工具非常有用

它可以直观的看到结合的信号的高低

如果我们的曲线

被压缩的看不清楚

可以用左键将想看的信号扩大

好 我们现在再生步骤已经开始了

大家可以看到

再生的时候有一个非常大的信号

这是因为

我们可以看到单独的3和4

这是因为

我们的再生液甘氨酸

和我们的Running buffer

它们的折光率非常的不一致

所以造成了信号差

现在我们的再生步骤已经结束了

那再生的好不好有两个判断标准

第一个就是我们要看它

再生之后有没有回到基线

也就是我们的分析物

有没有完全从配体上再生下来

可以看到我们这个再生的效果

还是非常好的

那再生的另一个标准就是看

再生之后

配体的活性有没有受到影响

那我们可以进行

第二次进样

相同的分析物

再进一次样

看结合信号有没有发生变化

好 我们第二次进样结束了

大家可以看到

我们第一次进样的反应值是16.4

再生之后我们进行第二次进样

它反应值是16.7

差别不大

所以这个再生条件是成功的

好 我们现在再加入再生液

让芯片回到原来的状态

好 现在我们的第二次再生也结束了

我们通过这个Reference Line可以看到

现在我们的芯片表面

恢复到了原来的状态

分析物已经完全从配体上洗脱下来

现在我们的分析物结合和再生实验就结束了

下一步我们要开始

我们的动力学和亲和力实验

动力学和亲和力实验

不能选择手动模式

一般都用Wizard的模式

在这里面

我们选择Kinetics/Affinity

双击

这里选择通道

因为我们的配体固定在4通道

所以我们要选择4-3

我们的芯片类型是CM5

那我们的实验流程主要是分为两步

第一个是加样品

第二个 就是再生

选择Next

Condition是问芯片是不是需要处理

这个我们不需要做了

然后Startup

Startup的目的

是让芯片先经过三个热身

这样的话

整个曲线的基线会比较平稳

Startup

我们一般是用运行缓冲液来进行

我们选择进行三个cycle

这是我们动力学的一些参数

我们这一次动力学

选择用120s的进样时间

我们的流速选择30 µl/min

解离时间选择300s

再生条件

我们的再生条件是甘氨酸

pH 1.7

我们的进样时间是20s

流速是30

点击Next

这时候我们需要输入样品的名字

这里可以通过复制

我们今天要做的浓度是

2 nM到32 nM

首先我们要走一个零浓度

在动力学和亲和力实验中

零浓度是必须的

在我们五个浓度里

我们选择一个浓度进行重复

好 我们下一步进行

如果我们的实验比较长

我们可以考虑把Sample compartment的温度设置的低一点

这样的话

我们的蛋白样品

在一个比较低温的环境中可能更稳定

这个选择我们的试剂架

选择Rack 1

这是我们需要的所有的样品

我们选择它们的位置

在这里面显示了每一个样品需要的体积

所以我们准备的体积

是绝对不能少于这个体积的

否则会有空气进样

这里边8 nM浓度我们是重复进样了两次

如果你想把它合并的话

可以在Menu里面选择位置

Sample的位置选择Pooling

这样的话

两个相同的8 nM

就可以在一个管子里

现在我们重新调整一下位置

好 现在我们就要准备

我们做动力学和亲和力的试剂

准备好之后

我们放入我们的样品仓

这时候程序会给出

我们预估的仪器运行的时间

然后需要的运行缓冲液的体积

你的运行缓冲液的体积

是不能少于这个体积的

我们点击Start

这个是问你要不要保存方法

我们可以保存方法

接下来

弹出窗口blr后缀的是实验结果

好 我们点击save以后

实验将会开始运行

现在我们的这个实验已经开始了

3通道的曲线

4通道曲线还有4-3

在这个右边

有一些信息

我们这一个

第一个cycle走的是Startup

走的样品是buffer

每一个cycle

都有自己的目的

我们Startup是前三个cycle

后面开始将会是

每一个浓度梯度

我们看一下

我们动力学和亲和力的实验结果

在这里面

我们有好几个cycle

每个cycle都有自己的进样

那我们想判断

我们想计算我们的亲和力的时候

我们从Tools点击

Evaluation的软件

好 现在我们的数据

用Evaluation软件打开了

Evaluation是Biacore的一个数据拟合的软件

All sensorgrams是我们所有的实验数据

基线 结合 解离 再生

那我们做亲和力拟合的时候

我们要点击Kinetics/Affinity

选择Surface bound

现在我们的所有线都出来了

那在这里边

这条灰色的线是零浓度的线

大家可以看到零浓度是非常重要的

因为我们的动力学是跟斜率有关的

而零浓度反应了整个基线的漂移情况

我们点击Next

将会扣减零浓度

剩下的就是我们真实的结合信号

一共有五个浓度

像我们这一个

它是有结合的速率

和解离的速率

我们就要选择Kinetics可进行下一步

在Kinetics里面

我们要选择合适的Model

大多数情况下

都是选择1:1 Binding的Model

当然里边还有一些别的Model

我们选择了1:1 Binding的Model以后

然后点击Fit

软件将会自动进行拟合

现在拟合结束

在这里有个Quality Control

它里面有一个评价

如果有三个是绿的话

那是说明结果是非常好的

我们点击Finish

这个拟合过程就结束了

它的名字可以出现在左边

现在我们看一下我们的拟合数据

点Report

在Report里面

这就是我们拟合出来的数据

最重要的是三个数据

ka kd 和KD

ka是结合速率

这一对抗原抗体的结合速率是9.4

乘以10的五次方

kd是解离速率

这一次是0.002794

那KD是kd除以ka得到的

是2.973乘以10的负9次方

那也就是说

这一对抗原抗体亲和力是2.973 nM

Rmax是

根据拟合出来的最大反应值

是35.36

而我们实际做到的最大反应值

最高浓度的反应值

也基本上快到了35

两者是非常贴近的

在这里面

拟合数据的好坏我们还会看两个值

一个是CHi²

这个值是越小越好

还有一个值是U-value

这个值当是1的时候

说明拟合的是非常好

今天我们的Biacore实验就结束了

我们获得了微球蛋白

和它抗体的动力学和亲和力数据

Biacore仪器的型号现在也有很多

不管是哪一种型号

检测原理和实验设计都是相同的

通过今天这堂课

我们希望能为大家了解这个技术

提供帮助

为科研工作提供支持