3.9 水溶性蛋白在线视频

大家好

我是中国农业大学的刘俊峰

非常高兴在蛋白质纯化和功能的

慕课中与大家见面

这节课是蛋白质纯化技术的

最后一节

在前面的课程里

大家已经系统学习了

各种层析技术的基本原理和步骤

以及这些层析技术在膜蛋白

和病毒粒子纯化中的应用

这节课

则以水溶性蛋白为对象

概括介绍蛋白质纯化的基本步骤

蛋白质的提取制备的过程以及

如何综合运用各种层析技术

来纯化目的蛋白

这节课中

我将与大家分享一下

三个方面的内容

第一个方面是

蛋白质纯化的前处理

介绍样品

如何从组织或细胞中释放出来

和如何进行

缓冲液的更换等内容

第二个方面是

结合具体事例

介绍

水溶性蛋白的纯化步骤和策略

第三个也是最后一个方面

则是针对包涵体

这一个重组表达蛋白中最常见的问题

来介绍如何利用

变复性技术从包涵体中

纯化出正确折叠的目的蛋白

大家都知道

蛋白质纯化的步骤

一般可以分为提取制备

捕获

中间纯化和精细纯化4个步骤

其中提取制备

是蛋白质纯化的第1步

在这一步骤中

我们需要将目的蛋白从

细胞或组织中释放出来

而这些

细胞或者组织

可能是来自于天然材料

也可能是重组表达的目的蛋白的细胞

蛋白质样品是如何从细胞中

释放出来的呢

我们可以采用物理或者化学的方法

将细胞破碎

物理的方法包括研磨

超声或者高压

这些方法都是更为剧烈的方法

研磨主要用于植物组织

以及冰冻的组织

超声破碎和高压

是破碎细胞或酵母

主要的方法

最温和的是用去诟剂来裂解

这是利用化学的方法打破细胞膜

新鲜哺乳动物细胞

常用这种方法进行破碎

有些情况下

细菌或者酵母

也可以采用这种策略

来释放目的蛋白

在这种方法中

添加细胞壁降解酶

可以提高裂解细胞的效率

在将目的蛋白从组织

或者细胞释放出来的过程中

一般需要适宜的条件

保证目的蛋白的稳定

使其处于溶解的状态

并免于被内源

或者外源的蛋白酶降解

因此一般需要一种溶液

这种溶液

需要具有保持稳定

pH值的缓冲液

适宜的盐浓度

以提供离子强度

以及添加防止组织氧化的还原剂

DTT或者巯基乙醇

这样的溶液

可以提供一个环境

稳定

从细胞中释放出来的蛋白质

此外

蛋白酶抑制剂

也是其常见组份

用于抑制蛋白酶的活性

来避免蛋白质的降解

除了上述组分

对于一些特殊蛋白质

则需要添加一些特殊组份

比如膜蛋白

需要添加去垢剂

而对于包涵体

则需要添加尿素

或者盐酸胍等变性剂

例如

哺乳动物蛋白

提取试剂盒中溶液

就包含如下一些组分

20毫摩尔的缓冲液

20毫摩尔氯化钠

以及添加剂等

这样的缓冲液可以用于

后续的纯化

检测以及功能分析

不需要做进一步的更换

但是

在大多数情况下

为了后续纯化

或者功能分析的需要

我们需要更换蛋白质的缓冲液

其中脱盐是最常见的缓冲液置换

下面以脱盐为例

介绍缓冲液置换的主要方法

常用的脱盐方法有透析

超滤和分子筛

透析

是将蛋白质样品

置于

具有半透膜的透析袋或透析管中

利用小分子可以透过半透膜扩散

而蛋白质分子不能的特性

通过多次缓慢交换

使得透析袋

或透析管中溶液的盐浓度逐步降低

从而达到脱盐的效果

这种方法的优点是

适合处理大体积的样品

其缺点是时间久

需要大量的缓冲液

超滤

也是以膜技术分离为主的技术

只不过它与透析不同

超滤采用压力而非扩散

推动进行大分子和小分子的分离

其优点是可以与浓缩同步

其缺点是时间长

超滤膜上会有蛋白的非特异性吸附

第三种方法是分子筛层析

前面的课程已经对

分子筛层析的原理

和方法做了详细介绍

分子筛层析

可以分开不同大小的蛋白质分子

也同样

可以把蛋白质与无机盐分子的分开

这种技术的优点是

速度快

脱盐彻底

其缺点是

通过分子筛层析以后的

体积会变大

一般需要增加进一步浓缩的过程

以上介绍了样品的前处理

下面开始介绍

水溶性蛋白的纯化步骤和策略

在大家进行蛋白纯化的时候

一个需要关注的重点是

蛋白质的纯度

我们纯化的蛋白质的纯度足够了吗

这个纯度

是否可以满足

后期的功能或者结构的需要呢

一般而言

我们都需要获得均一的样品

这是因为

均一的样品

才能够高效地开展后期的结构解析

和功能分析等研究的需要

以结构分析中的晶体生长为例

均一的样品更容易

堆积形成高质量的晶体

而不均一的样品

通常无法形成晶体

或者即使形成了晶体

其晶体的质量也不高

无法收集到高质量的衍射数据

下面的例子就是

蛋白质状态不均一

决定于晶体是否生长的具体实例

稻瘟病菌的海藻糖-6-磷酸合成酶

MoTps1参与海藻糖的合成

氧化磷酸戊糖途径

以及碳源代谢的调控

是影响

稻瘟病菌入侵植物的关键蛋白

其全长蛋白

在大肠杆菌进行表达

所表达的蛋白质状态并不均一

优化其纯化过程

也不能提高其均一性

纯化的样品经过

生长条件的大规模筛选后

还是没有长出晶体来

怎么办

我们进行了酵母表达

同样在酵母表达过程中

蛋白的状态还是不均一

所纯化的样品也没有生长出晶体来

然后

我们进一步改进

基于二级结构的预测

和同源结构的序列比对

设计表达了截断体蛋白

所表达的蛋白状态均一

经过生长条件的摸索

最终长出了晶体

并收集了衍射数据

和解析了其结构

为基于

病原物靶标结构

来设计新农药奠定了结构基础

以上的例子说明

用于结构解析

和功能分析的蛋白质样品

应该是均一的

那么

什么样的样品才被认为是均一的

这个均一性包括的范围很广

涵盖了蛋白质的纯度

电荷

疏水性以及

聚集状态的均一性等诸多方面

蛋白质的这些均一性

又是如何检测的呢

其实

用于纯化的上述层析技术

同样也是检测样品均一性的手段

例如

离子交换可以将

在某一条件下

电荷不均一的样品区分开

而电荷均一的样品

则以单一状态的形式存在

与此类似

分子筛

分析样品的聚集状态

亲和层析

检测标签样品的纯度

而疏水层析

则分析样品在疏水方面的均一性

上述技术

可以综合运用

检测样品的均一性

和最终纯化得到均一的样品

为了获得均一的样品

我们需要针对目的蛋白

设计纯化策略和步骤

不同的蛋白样品

由于其理化性质的差异

以及来源不同

其纯化策略

和采取的层析技术也存在差异

我们可以根据

样品的来源

来选择合适的层析纯化策略

对于重组表达的蛋白来讲

由于它一般带有亲和标签

常常以亲和层析

作为其第1步纯化

一些蛋白

经过一步亲和纯化

就可以达到均一的状态

当然

对于大部分的样品来讲

仅仅第1步的亲和纯化

还远远不够的

需要进行两步

三步甚至多个步骤的纯化

如加上离子交换

多模式以及分子筛层析

等等多种技术

才能获得均一的样品

天然材料中的蛋白质

则要复杂的多

对于有特定配体的蛋白质

如核酸结合蛋白

或者金属离子结合蛋白

它们可以参照

具有亲和标签重组蛋白的模式来进行

其它蛋白

第一步通常采用离子交换

或者多模式层析来进行

中间去除杂质的步骤

则结合上述两种层析及疏水层析

最后的精细纯化

则可以添加分子筛层析

最终根据电荷

疏水和分子量等差异去除其他杂质

具体例子如下

如去乙酰氧化头孢菌素C合成酶

由于没有标签

其纯化步骤就较为复杂

需要经过三个步骤

才可能完成其纯化过程

第一步的离子交换层析

去除了部分杂蛋白

而后续的

疏水层析和分子筛层析

则逐步去除了其他杂蛋白

获得了均一的样品

纯化的均一样品

可以生长出高质量的晶体

重组表达水稻

APIP6 的RING 结构域的纯化

其纯化过程非常简单

一步亲和纯化就可以获得

聚集状态均一的样品

该样品可以生长出高质量的晶体

而稻瘟病菌

PCG2-DNA 结合结构域的纯化

则较为复杂

除了第一步的亲和纯化之外

还需要利用离子交换

去除部分杂蛋白

才能获得均一的样品

下面围绕着包涵体的纯化

以及目的蛋白的变复性纯化进行介绍

包涵体是在

重组蛋白表达过程中

错误的折叠

导致蛋白质发生聚集而形成的

如何减少包涵体的形成

仍然是蛋白质科学的一个瓶颈问题

改变培养条件

和添加促溶标签等策略

尚不能完全解决这一难题

当蛋白质表达为不可溶的包涵体时

要得到具有功能的天然蛋白

我们以尝试用

变复性的方式进行纯化

首先必须在变性剂中

分散包涵体

从而得到一种溶液

这种溶液中的蛋白质

是去折叠的多肽链

该步骤叫做包涵体的溶解

下一个步骤

就是通过去除变性剂

使目的蛋白

重新折叠

最终形成正确结构的蛋白质

该步骤称为重折叠或复性

因此

与其他水溶性蛋白相比

包涵体的纯化增加了包涵体的分离

溶解以及复性等几个过程

其主要步骤包括

首先

通过高速离心

将包涵体与其他可溶性组分分离

然后

用一定的溶液

去除非包涵体组分

再进一步

用含有变性剂如

尿素或者盐酸胍的溶液

将包涵体溶解

最后通过柱上复性等方式

去除变性剂

使得目的蛋白重新折叠

以获得具有正确结构的

可溶性蛋白

一般来讲

分子筛（SEC）

亲和层析（AC）

离子交换(IEX)

及疏水（HIC）层析的介质

可以耐受

高浓度的变性剂

因此这些层析技术

可以用于柱上复性

以亲和层析复性的技术为例

带组氨酸标签的包涵体蛋白

其复性步骤是这样的

首先

用含有变性剂的

平衡缓冲液

冲洗层析柱

这是平衡层析柱的过程

然后将溶解的包涵体

注入到层析柱中

这是一个上样的过程

下面是复性的过程

通过逐步降低变性剂

如尿素的浓度

使目的蛋白重新折叠

然后通过咪唑梯度洗脱

将折叠好的目的蛋白

从层析柱上洗脱下来

最终在层析柱上完成整个复性过程

以上就是本部分的所有内容

最后

对本部分做一个小结

本节主要的内容包括

蛋白质的纯化步骤

包括

提取制备

捕获

中间纯化和精细纯化四个步骤

样品提取的步骤

包括细胞破碎的方法

及破碎后

稳定和保持蛋白质溶解度的条件

缓冲液置换的方式包括透析

超滤和分子筛层析

均一的样品

是蛋白质功能和结构分析的

前提和基础

层析技术可以检测样品的均一性

蛋白质的纯化

常常需要综合运用

各种层析技术

通过变复性的方法

可以从包涵体中

获得正确折叠的蛋白质

最后提供两个网络链接

第1个是蛋白质纯化手册的链接

上面有很多有用的信息

包括常见的层析技术

纯化策略以及困难蛋白的纯化等等

第2个是我个人在学校的网页

欢迎大家与我互动交流

多提宝贵意见和建议

谢谢大家