3.7.2在线视频

我们下面将通过三个实例

具体展示出

膜蛋白的表达和纯化

接下来讲第一个实例

这个实例是纯化

兔热病杆菌的膜蛋白CapA

论文的作者推测

CapA是一个

涉及多糖合成的聚合酶合酶

首先

作者将CapA基因

构造到含T7启动子的

pRSET质粒上

并与GFP基因融合

然后

作者将带有融合基因的pRSET质粒

转化到大肠杆菌菌株

BL21(DE3)pLysS

在TB培养基中培养

CapA蛋白通过

1mM IPTG诱导表达

在20摄氏度培养过夜

然后

在4摄氏度离心收集菌体

菌体超声破碎后

通过超速离心收集膜组分

并洗杂一次

接下来

作者通过去垢剂筛选实验来寻找

萃取效率高

且能够稳定该蛋白的去垢剂

首先

作者将待测去垢剂用水

配置成20倍CMC的母液

然后加入到悬浮了膜组分的

溶液中

各去垢剂的浓度

如表所示

膜与去垢剂在4摄氏度

孵育45分钟

然后超速离心去沉淀

上清通过western blot

以及荧光吸收

计算融合蛋白的萃取效率

结果显示

各去垢剂萃取效果都不错

其中

DDM和DM更好

作者进一步用

镍柱亲和层析回收

融合蛋白

亲和层析前

镍柱用含有去垢剂的溶液平衡

所用的去垢剂种类

和浓度如此处所示

需要注意的是

去垢剂浓度一般

控制在1.5倍CMC以上

但低于从

生物膜萃取蛋白所需的去垢剂浓度

为减少融合蛋白与镍柱的非特异性结合

结合液里含有20mM咪唑

洗杂液里含有50mM咪唑

洗脱液含有500mM咪唑

洗杂液和洗脱液都是10倍柱体积

这里

我们用SDS-PAGE银染结果

展示膜融合蛋白

在去垢剂

DM中的

亲和纯化结果

大家可以看到

融合蛋白主要在第4到6个柱体积

被洗脱出来

亲和层析回收的融合蛋白

进一步用凝胶过滤层析纯化

纯化结果如图所示

大家可以注意到

融合蛋白在不同的去垢剂中

表现出不同的寡聚态

譬如

在含DDM的溶液中

融合蛋白以十二聚体存在

在含DM

以及Cymal-6的溶液中

以五聚体存在

而在含CHAPS的溶液中

融合蛋白以四聚体存在

上述结果提示

去垢剂的种类和性质

是膜蛋白

结构与功能研究的重要变量

实例二

以Gamma secretase为例

展示真核膜蛋白复合物的纯化

这里展示的是

施一公实验室的工作

Gamma secretase

是跨膜的

蛋白酶复合物

包含四个亚基

分别是nicastrin

presenilin

APH-1

和Pen-2

Gammasecretase

在膜内剪切单次跨膜蛋白

促进这些蛋白的成熟

一些重要的单次跨膜蛋白

譬如

Amyloid precursor protein

CD44 Notch

都是Gamma secretase的底物

Gamma secretase的表达困难

一直阻碍了其结构的研究

施一公实验室构建了个性化的

质粒pMLink

将Gamma secretase

四个亚基的基因

分别置于独立的启动子控制下

通过瞬时转染

HEK293细胞

解决了Gamma secretase的表达难题

该蛋白利用去垢剂 CHAPSO萃取

用Anti-Flag亲和柱纯化

最后通过Superose 6

进行凝胶过滤层析

获得高纯的蛋白样品

更多的细节请学员们查阅相关的文献

这张幻灯片显示的是

gamma secretase

凝胶过滤层析的结果

gamma secretase的

理论分子量

大概在230 kDa左右

这里显示的表观分子量

在440 kDa以上

产生这种差异的原因主要有两点

首先

凝胶过滤层析显示的

膜蛋白颗粒尺寸

通常是蛋白

去垢剂 脂的复合物尺寸

所以比单纯的蛋白颗粒大

其次

gamma secretase

有翻译后修饰

最后的一个实例

是从天然组织猪心中

获得线粒体呼吸链复合物Ⅱ

线粒体呼吸链复合物Ⅱ

是琥珀酸脱氢酶

含有一个 FAD

一个铁硫蛋白

和一个血红素 b

复合物II的作用是催化电子从

琥珀酸转移至

辅酶 Q

这里展示的是饶子和实验室

提取线粒体呼吸链复合物的研究

该工作为从天然组织提取膜蛋白

提供了一个很好的样板

从天然组织中

提取特定膜蛋白的前提

是目标蛋白的丰度要高

因为不像异源表达

天然组织通常成分复杂

且目标蛋白难以通过

亲和层析来富集

线粒体是真核细胞

主要的能量供应单位

代谢功能旺盛的组织细胞

像心肌细胞和肾脏细胞等

有大量的线粒体

这些细胞为提取

呼吸链复合物II

提供了良好的物质基础

线粒体呼吸链复合物II的

纯化的简要流程如下

首先

将心肌组织分离和破碎

低速离心去除固体组织

然后对上清高速离心

富集包含线粒体的沉淀物

沉淀物用溶液重悬后

超速离心获得膜组分

然后

呼吸链复合物I-IV的混合物

用胆酸钠萃取

最终

呼吸链复合物II

通过硫酸铵梯度沉淀

和胆酸钠萃取的方法获得

目标蛋白样品中残留的硫酸铵

和胆酸钠通过透析除去

天然提取的呼吸链复合物II

晶体结构分辨率达2.4埃

它与抑制剂

nitropropionate

和TTFA复合物的晶体结构

分辨率也有3.5埃

最后

我们对膜蛋白纯化的要点进行总结

一 选择合适的表达体系

提高膜蛋白的表达量

二 选择最优的去垢剂

提高膜蛋白的萃取量

三 添加适当的脂类维持膜蛋白活性

到此

本节课程的所有内容讲解完毕

谢谢大家