2.2.1蛋白质电泳与免疫印迹（上）在线视频

大家好

我是来自于中国科学院

微生物研究所的王奇慧

我将为大家讲解

蛋白质鉴定中最常用的两种技术

SDS-PAGE等电泳

与免疫印迹的原理

操作及常见问题

也会简单介绍

几种常用的鉴定方法

我们首先介绍SDS-PAGE

在了解了蛋白质表达系统的

选择原则和构建策略之后

我们需要通过具体的实验

来检测目的蛋白是否表达

表达量如何

并且要摸索出

最适的表达条件

再进行后续的大量表达与纯化

在获得了纯化的目的蛋白之后

我们还需要进一步检测

经过一系列的纯化步骤

获得的目的蛋白

是否还保留了其在生理条件下的功能

因此还需要对纯化后的蛋白

进行简单的功能鉴定

最后再根据实验的目的

对纯化的蛋白进行具体的结构或是功能分析

其中

有两个环节都涉及到

对蛋白质的鉴定

第一个环节

是目的蛋白的检测

与表达条件的优化

实验中

最常用的手段

是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

蛋白质免疫印迹和质谱分析

有时遇到目的蛋白出现降解时

还需要进行N端测序

并且根据N段测序的结果

对表达的构建进行调整

在纯化后的蛋白

功能鉴定这一环节

当目的蛋白是酶类分子时

可以通过检测酶活性

而鉴定蛋白质的功能

当蛋白有相应的配体或受体时

则可通过检测与配体或受体的结合情况

判断纯化获得的蛋白

是否保留了生理条件的功能

那么什么是电泳呢

电泳是根据蛋白质在电场中的

迁移速度的不同

而达到分离的目的

蛋白质样品加到一块

预先配置好的凝胶介质上

只要在凝胶介质的两端加上电场

就可以达到分离蛋白质的目的

这样的电泳称之为凝胶电泳

淀粉

琼脂糖

与聚丙烯酰胺都可以形成

不同孔径的凝胶

用于样品的分离

其中

琼脂糖凝胶

主要用于DNA样品的分离

淀粉凝胶

主要用于血浆蛋白

和一些同工酶的分离

而聚丙烯酰胺凝胶电泳

不但可以用于分析核酸样品

而且还是目前应用最广泛

最为成熟的蛋白质分析技术

因此

今天我们重点讲解聚丙烯酰胺凝胶电泳

聚丙烯酰胺凝胶电泳

是由单体丙烯酰胺

和甲叉双丙烯酰胺聚合而成

聚合的过程是由自由基催化完成的

催化聚合的常用方法有两种

化学聚合法和光聚合法

实验室中常用化学聚合

这种方法以过硫酸铵为催化剂

以四甲基乙二胺

也就是TEMED为加速剂

在聚合过程中

TEMED

催化过硫酸铵产生自由基

自由基引发丙烯酰胺单体聚合

同时甲叉双丙烯酰胺

与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联

从而形成三维网状结构

如图所示

这种三维网状结构具有

分子筛的效果

带有同样电荷的两个蛋白

在相同的电场作用下

小蛋白比大蛋白

迁移的速度更快

根据是否加入变性剂

聚丙烯酰胺凝胶电泳

可分为非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

与变性聚丙烯酰胺凝胶电泳

在非变形聚丙烯酰胺凝胶电泳过程中

蛋白质仍保持其天然的形状和电荷

因而在电泳分离后

仍能保持其生物活性

这对于生物大分子的鉴定

具有非常重要的意义

因而也称之为活性电泳

在变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中

通常使用变性剂SDS

与还原剂如二硫苏糖醇

也就是DTT

SDS带有负电荷

同时它还有一个长的疏水尾巴

SDS通过疏水尾巴

与肽链中的氨基酸的疏水侧链结合

结合SDS的比率大约是

一个蛋白质分子中

每两个氨基酸残基结合

一个SDS分子

由于蛋白质表面

覆盖了大量的SDS分子

蛋白质本身的电荷性质

不再影响其在电泳中的迁移速度

DTT等还原剂的作用是

切断二硫键

同时

再经过沸水浴3到5分钟的作用

蛋白质会充分变性

多亚基的蛋白质

也将解离为单亚基

多肽链间

也处于无二硫键连接的分离状态

目前实验室中常用

不连续的电泳系统

也就是凝胶分为两部分

上层胶是浓缩胶

占总胶体积的小部分

浓度小于百分之五

绝大部分是下层胶

也就是分离胶

凝胶浓度大于百分之七点五

通常我们使用百分之八到百分之二十

对于不连续的SDS-PAGE

分离蛋白质的几种效应中

由于蛋白质分子表面

覆盖了大量的SDS

因而蛋白质本身电荷

不影响样品在电场中的迁移速度

样品往往有一定的体积

导致样品进入分离胶的时间不同

通过浓缩胶的浓缩

可使样品浓缩成很薄的起始区带

同时进入分离胶

在一定的分离胶孔径中

蛋白质分子越大

阻力越大

迁移速度越慢

因此

对于不连续的

SDS-PAGE来讲

蛋白质的大小

是影响分离效果的主要因素

表中列出了不同浓度凝胶的

线性分离范围

可作为实验中凝胶浓度的

选择依据

经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品

可用考马斯亮蓝染色

最常用的是考马斯亮蓝R250

也就是三苯基甲烷

偏酸性

结合到蛋白质的碱性基团上

其灵敏度最低可检出100ng蛋白质

根据条带的深浅粗细

可大致判断目的蛋白质的含量

银染是银离子

在碱性pH环境下

被还原成金属银

沉淀在蛋白质的表面上显色

灵敏度比考染高近一百倍

最低可以检出2ng蛋白质