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大家好 我叫缇耶里 纳阿斯

我是位于
巴黎南部郊区

比赛特医院的
一名医师

今天，我们将讨论
用于识别

细菌耐药机制的
基因型工具

为了说明
抗菌素耐药性的问题

我将使用一种
细菌大肠杆菌

它是我们最好的朋友，
同时也是我们最大的敌人

它是我们最好的朋友

与我们的消化道
共生的细菌

参与我们的
消化道的动态平衡

但与此同时，
它也是我们最大的敌人

因为它是造成人类
大多数感染的原因

15年前大肠杆菌是一种
多重易感细菌

可以在这里看到这种抗菌谱

这是研究抗菌药物
敏感性测试的表型测试

单独制作校准细菌

并在其上发现
含有一种抗生素的纸盘

这种抗生素将在琼脂中扩散

16小时后
将可以监测到细菌的生长情况

抗生素盘周围的
直径越大

细菌越容易受到影响

如您所见

15年前 大肠杆菌
对大多数抗生素敏感

今天情况已经发生了相当大的变化

像大家所看到的
大多数直径已经消失

有些虽然有直径

但仍然对这些抗生素
有抵抗力

基本上
大肠杆菌在社区和医院中传播

仍然只对
一类分子敏感

就是碳青霉烯类

这些是我们医院治疗中
使用的抗生素

尤以ICU为甚

当然
使用这种抗生素的次数越多

就会越多地选择细菌
对这种抗生素产生抗药性

这就是我们医院
现在发生的情况

这样的细菌 比如这个
也能抵抗亚胺培南

可以看到
并没有直径

这在欧洲是一个真正的问题吗

这在欧洲的一些国家
是一个真正问题

它始于几年前

希腊就是这种情况
因为血液感染而隔离的

三种细菌中的两种细菌
对碳青霉烯类耐药

这意味着
对许多抗生素有抗药性

在意大利 有三分之一，
在法国 不到1％

即使低于1％
假如你看一下流行病学曲线

在法国 你会看到
我们处于指数增长阶段

明确地来解释
这种碳青霉烯抗性细菌

仅对
一种抗生素

粘菌素敏感

它是一种高毒性的抗生素
其功效尚未得到充分证实

在使用这种
抗生素的国家，

例如意大利和希腊
会出现抗药性

然后就会产生泛耐药性

这意味着治疗进入死胡同
以及高死亡率

我们能做什么呢 当然
我们需要新型抗生素

但这是一项非常漫长的尝试

很难预见
这些分子什么时候能到来

但与此同时 我们可以尝试
防止这些漏洞的传播

为了防止扩散

我们需要确定
抗性机制

作为感染源

或作为
胃肠感染病菌的来源

因为患者可能是
没有感染症状的携带者

基因型工具的原理

来自于对抗生素的抗性
具有两种性质

第一个
是水平转移

一个抗性转移的细菌
对另一个细菌具有抗性决定因素

或者细菌
可能通过突变进化

这种突变赋予
对这种抗生素的抗性

基因型工具基于
DNA的多样性

可以通过基因扩增
分子杂交

或全基因组测序
来研究这种多样性的方式

原则总是
基于相同的

一种双链DNA分子
当加热它时

你会使它变性并
最终得到两个单链DNA分子

当再次冷却这种DNA时

将复活
双链螺旋

然而 当你在
DNA培养基中

添加称为引物的
小DNA分子时

那么 当你冷却它时

这些小分子的重新结合
比较大的分子更快

最终在这里会产生
一些小型混合动力车

然后 假如添加DNA聚合酶

就可以合成
相应的链

如果你多次重复这种变性，
复性聚合步骤

那么最终会得到
一个分子的情况

在第一个循环后
获得两个副本

依此类推 直到你完成35个循环

然后你最终得到2³ 这意味着
你的DNA分子有340亿份拷贝

说明这种信号增加的
另一种方法

是使用
终点技术

这意味着你要等待35个周期

然后取走得到的产物
并加载到琼脂糖凝胶上

通过
用溴化乙锭染色

在琼脂糖凝胶上迁移产物

将能够揭示
扩增产物

或者可以
实时跟踪

产物的积累

这是通过使用荧光
或者用通过使用绿脓杆菌

它是插入
双链DNA螺旋的化合物

或通过使用

将与扩增产物杂交的
分子探针

通过这样做
将能够实时跟踪放大

并可以量化
产物的数量

在这里
你的DNA增加了10倍

你会看到不同的曲线
来描绘扩增

分析扩增的PCR产物的
另一种方法

是使用反向杂交

扩增PCR产物
在一端被标记

并且DNA条带

包含几个
待识别的靶标

然后 取出PCR产物
将其与此条带杂交

只要特定的DNA条带可用

那么分子
就会杂交

这将告诉我们
比如在这里的示例中

在这个MRSA中有一个mecA基因

或者可以使用
微阵列布局

这次你会发现

这个膜上有DNA斑点
同理

做杂交
然后再发现

或者 也可以
使用PCR产物

然后用Sanger测序
进行测序

这是一个放大
被称为

喹诺酮抗性
决定区的例子

这赋予了染色体突变中
对喹诺酮的抗性

这里有野生型序列

然后这里是一个突变的序列
一个突变体

这里 可以看到这个突变
发生在A

它导致了喹诺酮抗性

当医院收到临床样本时

正常的路径是
经过24小时的培养

获得培养菌后

还必须等待24小时
来获得抗菌谱

然后 一旦获得抗菌谱
就需要进行测试

得以了解是否
存在抗性基因

这可能再需要24小时
甚至更长时间

这意味着至少需要3天时间
才可以获得最终结果

在这里 分子技术
发挥着重要作用

无论是直接在临床样本中
还是在抗菌谱上

因为可以在1至7小时内得到结果

这比3天快得多

因此 理想情况下 分子检测
需要比培养菌更快

它需要更精准

这两个很容易
1小时对比3天

更准精确 也更敏锐
可以使用临床样本

更容易 这并非无足轻重

有些更容易 但大多数时候
仍然需要经过培训的人员才行

理想情况下
它应该大多数情况下都更便宜

比经典的培养菌
要昂贵得多

对于感染
可使用直肠拭子

从患者身上
取一些粪便

然后经过24到48个小时

把它传播到
显色选择性培养基上

然后 制作一个抗菌谱

然后再次
进行确认测试

同样地
几乎要花3到4天才能得到结果

而同样 在这里
分子测试就非常快

可以获得非常迅速的
总结性结果

最近 测序也进入了
临床实验室

不过它仍处于发展阶段

我们拥有非常快速的新型系统
只要准备好DNA

只需要2小时的
周转时间

这种设备的价格
也大大降低到

临床实验室可以负担
的实惠价格

但是
那些非常快速的系统

每次测序运行的价格仍然非常高昂

所以 当然，
这不是人们可以

在临床环境中设想的
那需要准备很多样本才行

不过 它是一个有用的工具
这就是我们在医院做的事情

当细菌抗菌谱
非典型时

大多数经典测试都会失败
无法得到确凿的结果

那么 我们做了什么呢
做了DNA提取 准备了基因库

我们测序 全基因组测序，
生物信息学分析

这一切大约需要48小时

这让我们可以在48小时内
直接访问抵抗组织

但是 48小时作为诊断时间
还是太长了

测序的未来
可能与这个小设备有关

这是一个小口袋音序器
可以在这里插入电脑

可以在它上面发现你的

然后DNA碎片
被拉过纳米孔

当它被拉过
这个纳米孔时

根据核苷酸序列
存在电变化

它通过 然后你监视这里

根据电力变化，
可以推断出核苷酸序列

这是实时排序

而这个实时音序器
变得更加小型化

这里 我们有一部智能手机，
测序设备就在这儿

这实际上是一种可以
非常高效的

便携式测序设备

也可能是测序将在不久的将来
继续发展的方向

FDA已经在准备一些指导方针

以协调
所有这些测序

欧盟以及EUCAST

就是欧洲抗菌药物敏感性也是如此

试验委员会
也在做同样的事

他们还在考虑让这些新设备
进入医院

总结来说 基因型方法
基本上使一切都变得可能

想象力以及你有多少用来测试的钱

可能是你唯一的限制

为了让它们
进入临床诊断

就必须具有
医疗附加值

这是肯定的
对患者来说必须得有优势

它需要快速而具体

但是当然
每次测试都存在一些局限性

而且成本高昂
还需要专业人员

否定结果不排除
诊断失败

或否定诊断
因为你只能得到你要找的东西

如果你都没再寻找
那就一定找不到

它仅检测基因的存在
而不检测其表达

因此 它不会赋予表型

因为有时可能会出现
具有改变的表型

点突变衍生物

因此，到目前为止，

培养菌仍然是抗菌药敏试验的
黄金标准

因为我们需要的是一种表型

然后根据这种表型对患者进行治疗
非常感谢大家