流式细胞仪的数据显示及分析在线视频

同学们好

这个知识点我跟大家讲

流式细胞仪的数据分析及显示

在讲课之前我给大家提一个问题

假如你研究的课题中

涉及到PE和FITC双色的流式分析

为了得到一个可靠的实验结果

你觉得在流式分析中应该注意哪些事项

这里的PE和FITC是两种不同的荧光标记物

我们流式细胞仪它检测以后

得到的原始数据是这样一个表格

这样一个表格

这个表格我们可以看

这是标本1 标本2 标本3

这个标本1

它有前向 侧向散射光

荧光1 荧光2

它有四个参数

标本2标本3同样

这是它原始的数据

它给我们数据显示给我们看的有直方图

有散点图 有等高线图还有密度图

另外还有三维图

我们首先来看一下直方图

直方图本质上是统计直方图

它只能表示一个通道的信号

我们用DNA含量和抗原的表达来解释一下直方图

这个图中横轴是DNA的含量

纵轴是细胞数

这个是细胞在正常细胞状态下

我们的双倍DNA

这一段是四倍体DNA

有双倍DNA细胞有多少加起来整个面积

四倍有多少就整个面积

同样这是抗原

用APO2.7这个抗体

它标记的PE然后去跟这个抗原结合

然后我们可以检测到它含有这种抗原的细胞数

除了直方图我们还有双参数数据的显示

它是用于表达来自一个细胞

两个参数与细胞数量的关系

常用的表达方法有散点图

等高线图和二维密度图

在这个二维图中

X它这个是表示一个参数的数值

Y轴的一般是表示细胞的另一个参数

双参数图中可以将各细胞的亚群分开

同时获得细胞相关的一些重要的信息

这个是我们最常见的

我们在医院里看到的检验报告

血常规里面一个五分率的一个这个散点图

通过这种前向散射光它的高度

侧向散射光它的高度

可以把细胞区分出来淋巴细胞 中性粒细胞

甚至单核细胞都可以分开过来

这里的红细胞是被溶解了

散点图它能够同时显示两个通道的信息

能够直观地发现群体中

这两个通道的相互高低关系

然后还有更加易于细胞分类 细胞分群

以及确定它们的比例关系

这个图显示的你看这个我们是把这里

用侧向和前向两个参数

散射光的参数确定

通过设门的技术把这一批内淋巴细胞画出来

然后再用CD4和CD3这样的抗体

把细胞分群分开

还有就是等高图和密度图

这个是一个密度图

它能够直观地体现细胞群体的集中点

它通过这个密度显示

处于这个参数的细胞非常多

然后就是三维图

这个是个简单的三维图

高度是细胞数量

然后前向散射 侧向散射

通过这种三维显示过来

这个就是比较复杂的

它去用CD4一个参数FITC

CD14是一个参数

再加上一个侧向散射光

这个三个参数

然后做成一个这个三维的立体图

还有一个就是它这些点点散点图

我们把它整合进来了

我们代表这个细胞数量

实际上我们可以把四个参数整合在一起

是吧

流式细胞数据分析里面非常重要的

还有一个就是这个补偿调节原理

叫做光谱重叠

我们知道我们用FITC PE来激光照射以后

产生这两个波长

我们要检测它

我们从510到550

我在510到550检测的

除了有80%的FTC集中在这里

还有20%在其它的地方

还有5%的PE在这里

我们要怎么想办法要把这个5%的PE给去掉

让它不干扰我这个FITC的检测

其它的也是类似的一个原理

这里就是我们一个方法

我们补偿调节我们第一个通道是

第一个通道代表F1TC的信号

第二个通道代表PE的信号

我们设置一个阴性对照

这个里是不标记的

然后第一个是用这个FITC标记CD8

第二个是用PE标记CD4

然后用标记CD8的来调节PE FITC的补偿

我们看下面一个图

这个是我们具体的方法

这个是我们为补偿正确补偿或过度补偿的

一个这个示意图

我们在用FITC标记CD8

然后这个是PE

我们实际上就是没有标记PE 是吧

我们在调节的时候

我们要调节到你看这个PE应该是阴性的

所以要调节到这种地步

如果我们调节过分了

它就会往下走

我们调节的原则是要让这个数据横平竖直

这个是用FITC来补偿PE的

然后用CD4标记

然后我们最后把最后补偿好的结果我们可以看到

这个就是我们真正要得到的一个数据

横平竖直结果很长

如果没有补偿的话

你看它很多数据在这里

补偿过度的话

它就会有一个鞘限

有一个鞘限

这个是我们经常要补偿的

怎么来调整

就是我们通过电压来调整

我们在做流式细胞

除了两色我们还有三色可能还有四色

三色分析补偿调节方法

向我们这里有多个的

你看三色的我们有FITC标记的

有PE标记的

然后用PE-Cy5标记的

三色通过这种阴性对照调节

三种补偿最后观察它的结果

三色调节根据两色条件一样的原理

可以做三色调节

我们流式细胞它的数据分析

我们需要考虑到仪器的型号

荧光素偶联抗体 细胞以及补偿调节的影响因素

所以再加上我们还要考虑到

合理的去设计这个阴性对照

还有怎么设门

要考虑到很多的因素

这个数据分析

它是一个经验性非常强的一个这个工作

所以这个流式细胞技术

就是这样一个需要经验的技术

它要进行数据分析时

要多方面考虑这些影响因素

尤其是补偿是否调节得当

如果补偿不当的话

它的结果可能截然不同

我们再回到我们课程开始的时候的一个问题

在进行PE和FITC双色流式细胞中

首先在实验设计上

我们就应该考虑一个阴性对照

以及两个单阳的调节补偿

然后才能获得双标记的实验

得出一个精确的实验数据

我们今天的这个课程就讲到这里

谢谢大家