分子生物学实验技能培训在线视频

同学们 大家好

我是来自中南大学湘雅三医院

医学实验中心邢晓为

我今天给大家讲的是

分子生物学在临床研究中的应用

在这一讲里面

我们主要是进行分子生物学实验技能的培训

第一 我讲一下移液器的使用

第二 介绍一下PCR技术

第三 介绍一下RT-PCR技术

第四讲一下Western blot技术

移液器的使用和注意事项

我们在分子生物学实验的时候

经常我们所使用的移液器是有不同规格的

有1000微升的 有200微升的

有100微升的 10微升的还有2微升的

这是Eppendorf移液器

这是吉尔森的移液器

这是我们国产的大龙的这种移液器

不同的移液器它的调节方式是不一样的

比如像这种移液器

我们就要按下左键然后再去调

像这种移液器我们调的时候先进行粗调

然后进行微调

像这种移液器

我们可以直接旋转旋钮就可以了

这个移液器我们调了以后

首先我们要看一下它的一个数据框的读数

然后移液器与这个tips在结合的时候

要进行紧密结合

不能中间有空隙

有空隙的话吸样就不准

这是一方面

第二个我们吸粘稠液体的时候

我们需要将这个tips这个头剪掉

这样的话能够吸的更准一些

移液器的使用注意事项里头

我们在吸液体的时候

注意我们这个移液器枪这个枪要垂直

垂直进行吸

吸了以后

我们是第一个档位

吸了以后抬起来

然后我们再把它打下去的时候

沿着管壁轻轻往下打

tips有残留

我们通过把它枪按到第二个档

然后将tips中的残余液体全部打出来

然后再让它松开

我们在这个移液器不用的时候

把它调到它这个枪身上所标记的这个最大刻度

下面我给大家讲一下这个PCR技术

PCR这个技术是分子生物学中

应用最为广泛的一个技术

它是双链DNA在多种酶的作用下

可以变性解链成单链

在DNA合成酶和启动子的参与下

根据碱基互补配对的原则

复制成同样的两分子拷贝

这个技术最开始是在1985年

由美国科学家首次发明的

这个技术在1993年获得诺贝尔奖

PCR它的一个基本特点

就是这个技术特异性特别强

而且灵敏度高 操作简便 省时省力等

这个技术包含以下一个流程

第一 变性

双链DNA打开以后变性然后退火

引物结合上去退火

然后进行延伸 循环

做完以后进行电泳检测

我们下面用图片给大家演示一下

这个PCR就是最开始它变性的时候

DNA双链打开

在退火的时候

前向引物和反向互补引物

分别结合到它的两个链上

然后再进行延伸

延伸的时候

前面从5'端到3'端延伸

这样的话从一个分子形成了两个分子

引物结合上去以后就进行延伸

分别进行从5'端到3'端的延伸

这样一个分子就形成了两个分子

然后从一个拷贝变成两个拷贝

两个拷贝变成四个拷贝

以几何倍数的形式增加

它这个增加是不是无限制的

不是的

它会出现一个平台效应

会出现这个平台期

什么是平台效应

就是经过一定数量的循环以后

随着产物对数累计趋于饱和

DNA片段不再呈这个指数增长

而是进入线性增长期或者静止期

我们把它称为这个平台效应

是什么因素影响这个平台效应

第一 引物还有这个dNTP

它浓度下降了以后掺入的速度是减慢的

第二 酶与模板的比例开始下降

这样的话就会形成一个平台期

PCR反应体系与反应条件

这是我们常规所应用的一个反应体系

这个反应体系里头包含了水

然后反应的缓冲液

有的需要加镁离子 有的不需要

然后Taq酶 dNTP 引物 模板

我们通常在做的时候

做10微升体系进行摸索条件

但是在正式实验的时候

我们都是做20微升以上体系

这样的话保证了这个反应体系的稳定性

我们家好样本以后

然后在PCR仪上进行运行

首先用95℃进行预变性

预变性了以后

然后进入这个变性程序

94度变性

然后引物的退火温度一般是58到64

所以我们大家在设计引物的时候

要注意这个退火温度不要太高了

也不要太低了

然后延伸

延伸一般是1KB一分钟

也就说是你每扩增1KB我们需要延伸一分钟

然后进行35个cycles的扩增

扩增了以后在72度进行延伸把它补齐

最后进行保温

然后将PCR扩增出来以后

我们进行电泳检测

这就说是我们常用的这个PCR仪

扩增的产物

我们要进行这个电泳检测

这就是琼脂糖电泳检测

这是聚丙烯酰胺凝胶电泳

琼脂糖电泳一般可以检测

从0.1到60个KB

而聚丙烯酰胺凝胶

它的检测范围一般是小于1KB的

所以这大家需要注意的一点

如果说你想区分得非常清楚

差一个碱基都可以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳来实现

RT-PCR原理

RT-PCR是一条RNA链

被逆转录成为互补DNA

然后再以此为模板

通过PCR进行DNA的扩增

RT-PCR它的优点是什么

它的优点可以组织表达谱的检测

它灵敏性比较高而且操作简单

但是也有缺点

它跟Northern blot比起来

它不能检测基因的原位表达情况

也不能反映基因的真实大小

不能反映基因有几个转录本

同时有时也会出现这个假阳性

RT-PCR的一个基本流程

我首先提取RNA

然后进行逆转录

逆转录以后进行PCR扩增

最后进行电泳检测

在这里面大家需要注意的一些问题

比如说我们提到RNA产量太低

或者说是它的OD值太低

我们一般在这个260:280这个比值

一般是控制在1.8到2.2是比较好的

然后另外需要注意的几个问题

就是在RNA抽提的时候

主要是避免这个人为造成的污染

所以尽量是戴帽子戴口罩

第二 在逆转录的时候

所增加的模板并不是越多越好

而是说要有合适的比例

第三扩增的时候

我们所涉及的引物尽量跨这个外显子

跨了外显子

我们避免这个RNA里头混杂了DNA对它的影响

最后这个人RNA要在-80度以下保存

Western blot通过特异性抗体

对凝胶电泳处理过的细胞

或者生物组织样品进行着色

通过分析着色的位置和着色的深度

获得特定蛋白在所分析细胞或组织中的表达情况

我们分析通过这个着色的位置

可以分析出这个蛋白的大小

可以通过着色的深度

与这个对照组相比

我们可以获得这个蛋白表达高低的一个信息

在进行Western blot的时候

它的一个基本操作流程是首先制备样本

然后进行SDS-PAGE的电泳检测

电泳用完了以后把它转到膜上

进行封闭 一抗杂交

洗脱了以后进行二抗杂交

然后进行显色和照相

这是我们做Western blot所常用的仪器

首先在制胶上进行制胶

然后进行电泳

然后转膜

这是电泳仪

转完膜以后然后再进行显色

在照相系统里头进行照相

Western blot它的一个核心成功要素

第一个要有足够的蛋白结合到膜上

第二要保证我们的抗体与抗原能够有效地结合

第三要有灵敏和高效的检测系统

这是我们保障Western blot能够

获得好的结果的三个主要要素

同学们在这节课里

我们给大家主要讲了移液器的使用

PCR RT-PCR和Western blot

这个知识点我就讲到这里

谢谢大家