体内药物分析技术——样本处理技术在线视频

大家好我是裴奇

来自中南大学湘雅三医院

我们这节课讲授的是

体内药物分析技术的样本处理技术

我们知道体内药物分析

它是药物分析学派生的一门学科

它主要是分析机体的药物浓度和代谢物的情况

通过浓度我们获得药物动力学参数

然后基于这些参数和药物浓度

我们来指导药物的开发以及临床的合理使用

我们生物分析的对象主要来自于组织和体液

体液主要包括血液 尿液 粪便

然后胃液 脑脊液等等

在这个里面我们绝大部分分析的都是血液样本

血液样本如果是抗凝的血液样本

我们主要是测定血浆中的药物浓度

如果是促凝的样本

我们主要测定的是血清药物浓度

对于像他克莫司这样的免疫制剂

我们要测定它全血中的浓度

稍微提醒大家的是

在平时我们的药物

不管是血浆的药物浓度和血清中药物浓度

它们基本上是相等的

所以说这两类样本的测试

基本上没有什么太大的区别

看看这个血浆样本它有一些什么样的特点

首先它的杂质很多

比如说它里面有很多的蛋白质还有磷脂

然后第二个就它的浓度非常的低

通常来说它都是纳克每毫升这个级别

对于很多药物它可能会达到皮克级别

所以这对我们分析来说要求是非常高的

所以说我们的样本处理主要从两个角度

去处理去解决这个问题

第一就是我们要去除蛋白质

当然这步可以认为是一步纯化的步骤

第二我们就需要进行富集

那我们来具体看一下

首先第一个方法是蛋白沉淀

蛋白沉淀我们所使用到的主要是有机溶剂法

强酸法 中性盐或者是金属沉淀剂

有机溶剂中我们主要是乙腈和甲醇

然后强酸主要用的是高氯酸

但因为高氯酸沉淀之后

它上清液是偏酸性的

这样对于我们后期的色谱柱的寿命是有影响的

所以说在大部分实验室

现在我们的蛋白沉淀首选的主要是有机溶剂

通常来说我们是一份的血浆样本

加上两份体积的有机溶剂

然后进行涡旋 然后离心

最后获得上清

我们就可以直接进样

在这个地方提醒的是

虽然我们临床上很多药物它的血浆蛋白结合率

高达可能90%甚至95%

但是在我们去除蛋白的过程中

这些药物是能够从上面释放出来的

所以说我们测定的其实是

总的药物浓度

而不是游离的药物浓度

第二个处理方法是液液萃取

液液萃取它的原理是基于药物

和杂质它们的一些特性不一样

主要是比如亲脂性的不一样

这个时候我们加入一些有机溶剂

将药物从杂质中萃取出来

常用的有机溶剂主要是乙酸乙酯

二氯甲烷和叔丁基甲醚

它的步骤是比如说一毫升的血浆

我们加入三毫升的乙酸乙酯

然后进行涡漩离心

然后上清液取出之后

我们进行进样前

在水浴下可以用氮气进行吹干

吹干之后我们可以向玻璃管中

加入一定体积的复溶液

通常来说可能是一百微升

所以说从体积上来看

最开始是一毫升的血浆

到最后我们处理完之后

它变成了一百微升的溶液

所以药物的浓度整整提高了将近十倍

它的优点就是我们不需要特别的装置

而且它的提取回收率也比较高

将近有50%

但它的缺点就是

相对来说操作非常的繁琐 费时

不便我们自动化

而且溶剂用量也比较大

所以这样对于实验人员和对于环境

都是一个比较大的影响

第二个处理方法是固相萃取

固相萃取它用到的是萃取小柱

这是一个萃取小柱的示意图

这是聚丙烯的柱管

它中间填有复合填料

然后上下都有筛板

这种小柱它是一次性使用的

也是我们说的一种耗材

但它的稳定性非常好

也就是说它每次

提取的回收率是能够得到重现的

那我们具体看一下固相萃取它的步骤

它一共有四个步骤

第一个步骤

固相柱的预处理

我们可以叫做活化

这个活化过程中主要用到的是甲醇和水

然后第二步我们在这个地方进行加压

第三步我们会进行洗涤

洗涤的目的主要是为了

将这些杂质给洗脱出去

最后一步我们会选择特定的洗脱溶剂

然后将我们的目标化合物洗脱出来

如果说浓度达不到我们的检测要求的话

我们可能会对这个

收集液进行吹干

然后再重新进行复溶

上面这个就是一个手动的萃取装置

我们可以看到这是一个玻璃缸

板上面一共有12个孔

每个孔上面可以放一个这样的固相萃取小柱

它一次性可以处理12个样本

这个地方连接了一个

可以抽真空的管子

所以它主要靠的是负压

进行萃取的

相对应的这底下的叫做自动萃取装置

因为我们知道很多时候我们处理的样品

可能都是以几百个这样来计算

所以这个时候如果用这种手动萃取装置

效率太低

这种自动萃取装置

它使用的固相萃取

也不是叫做固相萃取小柱

它用的是这种96孔的萃取盘

它和我们96孔板是类似的

只不过它更厚

然后它底下铺了一层填料

固相萃取它的优点

主要是不容易乳化 提取回收率高

方便 快捷

溶剂的用量也比较少

便于我们进行自动化

但它的缺点主要就是贵

它的贵主要体现在首先这个

萃取柱本身 一般小柱是30块钱

对于这种萃取盘一般3000块钱

对于这样一个自动的萃取装置

通常需要50万左右

所以固相萃取主要就是成本比较高

然后相对来说

和我们蛋白沉淀这种方法去比

它也相对比较的繁琐

最后对样本处理这个知识点进行小结

处理方法首选就是蛋白沉淀法

它主要是操作简便

然后也不需要特别的一些装置

它的缺点就是纯化的效果相对较弱

对于后面的质谱检测来说

它有可能会引进基质效应

对于液液萃取

它的优点主要是不需要特别的一些装置

所以在所有的实验室几乎都能开展

但它的缺点就说操作繁琐 费时

需要大量的有机溶剂

而且我们不便于进行这样的自动化

而且对环境和人员都有影响

最后固相萃取

它和液液萃取相比 它能够节省溶剂

它能够实现自动化 重现性也好

而且它的纯化效果

也比蛋白沉淀好

但是它的最大缺点就是前面说到的

成本比较高

此外需要专业人员来协助开发方法

因为它最后洗脱的时候

它需要选择不同的洗脱溶剂

以及调整pH值或者不同的比例等等

所以这个地方需要专业人员进行协助

这个知识点就到此结束

谢谢大家