当前课程知识点：医学实验技术与方法新进展 > 第二章 流式细胞术在科研中的应用 > 第3节 流式细胞仪的应用 > 流式细胞仪的应用
同学们好
这个知识点我跟大家介绍
流式细胞术的应用
在讲课之前我也给大家提个问题
假如你的研究课题需要检测
小鼠脾脏中B细胞增殖实验组
与对照组是否有差别
你会怎么设计你的实验
要回答这个问题我们先来看一看
我们的流式细胞术的应用
随着流式细胞仪的发展
新荧光素的发现
以及发明流式细胞术的应用越来越广泛
那本次课将会具体介绍
流式细胞术常用的一些经典的几个方面的应用
并罗列出流式细胞术常见的其它应用
同学们可以根据自己掌握的实验具体需求
然后去具体了解其它相关方面的应用
流式细胞术的应用
有细胞群比例的测定 表型测定
测量细胞因子等等等等
我们罗列出这些应用
然后我们本次要讲的就是五个方面
前面我们三个黑色标记的
还有这个细胞凋亡
还有细胞周期
这些应用
这是我们这次课会具体给大家举个例子的
我们首先来看细胞群比例的测定
这个是流式细胞术最基本的简单的应用
我们这个就流式细胞术测定出来的结果
这个就是在白细胞里面
把淋巴细胞单独把它分列出来
然后直到这个T淋巴细胞 CD3阳性
T淋巴细胞在白细胞中它的比例情况
是针对细胞群体已经明确的细胞
群体特征已经明确的细胞我们做一个
群体比例的测定
第二个举例我们是细胞表型的测定
表形测定就是细胞或者是
细胞亚群表达的一些重要的抗原分子的情况
研究表形可以从一定程度上判断
这群细胞的特征和它的功能状态
图A和图B它是不同功能状态下
NK细胞CD11b表达量的一个测定的一个结果
这个不同的颜色它代表的是NK的前体细胞
这前面是一个隐性对照
非成熟细胞CD9阳性 CD9阴性的NK细胞
这个不同的NK细胞
它CD11B的含量
这个横轴是CD11B它的含量高 含量低
这个B图
B图1天一周 四周 八周
NK细胞它CD11B它含量
在明天的时候是这么多阳性的
随着时间的增长
到最后它达到了78.2
C图
C图是不同亚类的CD细胞
这个CD11B的含量
你像CD13 CDCY49它的含量
我们检测还可以检测细胞的增殖
这是一个例子
细胞增殖是这个细胞的一个重要功能
我们检测细胞增殖有四种染料法
我们说CFSE法
它的一个重点就是它标记细胞以后
跟这个蛋白染料跟蛋白质结合以后
随着细胞的分裂
它在细胞中就分裂
一个分成两个它就剪成一半
两个再分成四个它也剪成四分之一
随着它的分裂而减弱
这个是CFSE它的含量横轴
这个是标记的细胞数
随着它分裂的话它就会减半
这个图就是从这个框里面门里面框出来的这个图
你随着细胞的分裂
这个是细胞数
标记的数随着它的分裂
分裂多的话
它的这个整个的量就减少
那就是说分裂多的话
它的细胞数在减少这反应细胞的增殖
这是另外一个叫做渗入法
渗入法就是这个BRDU它可以渗入到
胸腺嘧啶里面去
它合成的时候它就渗进去
这个是没有渗入之前
FITC标记的这个Brdu它是阴性的
它整个是看是阴性的
我渗入之后
这个CD4是APC这个细胞
不管它含量低的含量高的
它FITC标记的阳性部分就增多
表明了细胞的增殖
随着细胞的增殖
它渗入的越来越多说明细胞的增殖能力
还可以就是说来反应细胞的凋亡
流式细胞术是检测凋亡的一个重要手段
它可以定性还可以定量
通常我们用这个Annexin V PI的方法
还有其它的方法
这里我介绍一下Annexin V PI
这个Annexin V它可以跟
细胞膜上面的这个磷脂酰丝氨酸结合
磷脂酰丝氨酸在细胞正常的情况下
它是在细胞膜内的
当细胞凋亡以后它会翻出来在膜外
所以它可以了解细胞凋亡和活细胞
还有一个就是PI
PI可以区分活细胞和死细胞
它怎么区分
细胞死了PI就能够进去跟DNA结合
如果细胞是活的它就没办法进去
所以它可以区分
通过这两个参数我们可以看到
横轴是Annexin V
纵轴是PI这个是活细胞
那就是说PI是没有进去的
PI是阴性的 没有进去的
Annexin V没有膜外翻它是阴性的
它是活细胞
这个是凋亡细胞它并没死
PI没进去膜还是好的
这个就是坏死细胞
它Annexin V和PI都有反应
都是阳性的
还有就是它的应用用于细胞周期的检测
我们知道细胞周期从有丝分裂
然后这个是G0S期 G1期
在不同的时期它的核酸的含量是不一样的
就是DNA的含量是不一样的
这是一个非特异性核酸标记的一个原理图
我们看到G0期
它对应的是这个是双倍体期
随着它这个G0期 G1期
这个是S期 G2期
G2期和有丝分裂期它是双倍体的
所以它这里是双倍体DNA
这个纵轴是细胞数量横轴是DNA的含量
通过这样一个结果
我们知道细胞处于哪个周期的细胞是比较多的
处于哪个周期 哪一个时期的细胞是比较少的
我们检测细胞周期还有很多种染料
这个是我们前面讲的这个
PI FITC等其它的染料
不同的染料它有不同的特点
我们要根据它的特点来解决我们的问题
这个是一个非特异性标记的就是我们实际的图
刚才那个是原理图这个是我们实际的图
很简单
而且可以得到它不同有丝分裂期
细胞周期不同时期的它的细胞数 比例数
我们再回到我们课程开始的问题
检测小鼠体内脾脏B细胞增殖情况
根据我们刚才讲的内容
检测体内细胞增殖的方法
比较好的是这个Brdu渗入法
因此我可以这样的来设计这个实验
在检测前16小时或者更短的时间
我们这个需要做预实验
腹腔注射一定剂量的Brdu
然后处死小鼠取出脾脏
研磨成单细胞的悬液把红细胞裂解
然后用荧光素偶联CD19抗体和Brdu抗体
荧光素它的选择
我们就要根据上面的荧光素进行选择
然后还要做补偿调节的一些参考课件
前面都讲过
然后我们再来做流失分析
这一次的知识点就讲到这里
谢谢同学们
-第1节 医学实验中心基本情况
-第2节 研究人员进室流程和管理制度
-第3节 实验实施
--实验实施
-第4节 实验总结
-- 实验总结
-第一章 课件
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-第3节 流式细胞仪的应用
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-第二章 课件
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-第1节 NCBI相关资源
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