当前课程知识点:2015年清华大学研究生学位论文答辩(一) > 第3周 水利系、微纳电子系、工物系、材料学院、医学院、法学院 > 医学院-江力玮 > 答辩陈述
返回《2015年清华大学研究生学位论文答辩(一)》慕课在线视频课程列表
返回《2015年清华大学研究生学位论文答辩(一)》慕课在线视频列表
大家早上好
欢迎大家今天来到
左腾和江力玮的博士答辩会
我是张绮
是张林琦老师的博士后
今天代替史老师来担任
这个答辩秘书的工作
首先我们请答辩委员会主席
陈应华老师来宣读
答辩委员会的成员名单
并且宣布这个答辩会正式开始
下面我公布一下
这次答辩委员会的组成
这个梁米芳研究员
是中国疾病与预防控制中心
病毒学预防控制所
何玉先研究员
中国医学科学院
病原生物学研究所
王新泉教授
清华大学医学院
谭旭研究员
清华大学医学院
再我本人
清华大学生命科学学院
下面我们开始
首先让导师介绍
这个研究生的基本情况
这个今天答辩的第一位
按照上面来的是江力玮
江力玮同学
首先导师介绍江力玮同学的
基本情况
我叫张林琦
是江力玮的博士生导师
首先欢迎各位评委
在百忙之中抽出时间
来参加江力玮的博士论文答辩
首先呢我想介绍一下
她的情况
江力玮同学是1987年5月
生于安徽省合肥市
2005年毕业于咱们
南方医科大学临床医学专业
并获得学士学位
2010年9月直博生
进入我的实验室
在过去的五年学习期间呢
江力玮同学学习努力
完成了所有的课程
以及通过了博士生的资格审查
也发表了相关的论文
在外审的三位评委的评语之中
对于江力玮的论文的
创新性理论意义实用价值
以及在其中反映出的理论水平
和专业知识
还有写作水平
和博士学位论文的学术水平
均给了全优
今天呢进行博士论文答辩
介绍完毕
好 谢谢张老师
下面请博士生
江力玮同学报告她
博士论文的主要内容
时间是30到45分钟
各位老师和同学大家上午好
我叫江力玮
是清华大学医学院2010级直博生
我的导师是张林琦教授
我博士阶段研究的主要课题是
针对中东呼吸综合症冠状病毒
中和抗体的筛选及机制研究
2002年重症急性呼吸综合症
SARS在整个东南亚地区
甚至全球引起爆发
持续大约两年的时间
该疾病主要就是
由SARS冠状病毒引起的
在当时感染者超过了8000人
死亡率高达10%左右
SARS在人群中的传播
主要是通过人和人之间的接触
进行传播
当时这一事件提示着我们
动物来源的冠状病毒
对人类有着潜在的威胁
在人身上可以引起
严重的疾病和爆发流行
10年之后2012年
又有一种新型的冠状病毒
首先在中东地区被发现
它引起的急性呼吸系统的症状
与SARS当时非常的相似
我们将这种新型的冠状病毒
称为中东呼吸综合症冠状病毒
简称为MERS
目前该疾病已经由中东地区
传播到欧洲东南亚
以及最近疫情非常严重的
韩国地区
到截止到6月6号为止
该疾病的感染人数
已经达到了1185例
死亡率接近40%
远高于10年前SARS的10%
现在韩国的疫情
还在不断的持续当中
新发病例不断的发生
MERS在人群中的传播
也主要是通过
人和人之间的接触传播
但是这种传播只是小范围的
是非常有限的
目前还没有证据证明
它会像当年的SARS一样
进行大范围的扩散
对于这种死亡率高达40%的
新型的冠状病毒
目前我们迫切的需要
有效的疫苗
以及治疗手段
来预防和控制疫情
结合本实验室的研究优势
和研究方向
我们提出了我们的目的
是分离
针对MERS的人源的
单克隆中和抗体
为了达到这个目的
首先我们需要
对MERS冠状病毒本身
进行深入的了解
和其他的冠状病毒非常类似
MERS冠状病毒
也是一个单股正链的
RNA病毒
包膜上主要包括三种蛋白
S蛋白 E蛋白和M蛋白
S蛋白是与受体相互作用
可以介导病毒进入宿主细胞
而E蛋白比较小
是嵌合在病毒的包膜之中
M蛋白是一个跨膜转运的蛋白
它主要和病毒的出芽
以及整个病毒包膜的形成有关系
而在病毒的内部
主要就是病毒的核蛋白
和RNA的复合物
前面我们已经提到
MERS冠状病毒
是利用S蛋白与受体结合
从而介导病毒与宿主
发生膜融合
S蛋白是以三聚体的形式
存在于病毒表面
包括S1和S2两部分
S1蛋白可与受体相互作用
相互作用之后
它从S2蛋白上脱离
从而暴露了这个疏水性的
FP的结构域
随后FP的结构域
插入到宿主细胞膜上
形成了这样一种膜融合的
中间的过渡状态
随后HR1和HR2两部分相互靠近
形成了一个大的结构域
随着这个过程的进行
将病毒的膜和宿主的膜
相互拉进
最后完成了整个膜融合的过程
虽然目前关于MERS冠状病毒
膜融合过程中的细节
并没有完全清除
但是MERS冠状病毒
它膜蛋白的组成和
以及膜融合大致的过程
和其他的冠状病毒
是非常类似的
所以如果能有抗体
抑制S1蛋白和受体结合
或者是抑制膜融合过程中
这些构象的改变
这些抗体就具有中和活性
所以我们的目的
也就是分离到
这一类的中和抗体
2013年初一个荷兰的研究组
首先鉴定了MERS病状病毒的
细胞受体是人源二肽基肽酶4
简称为DPP4
又称为CD26分子
那么冠状病毒是如何
识别这个受体的呢
2013年7月清华大学生科院的
王新泉老师实验室
和中科院微生物所
高福老师实验室
几乎同时鉴定了MERS表面
S蛋白的受体结合域
是S1蛋白上的367位氨基酸
到606位氨基酸
同时他们还解析了
这个RBD与DPP4复合物的
晶体结构
这两项研究详细的阐明了
MERS冠状病毒
是如何利用RBD来识别
受体DPP4的
同时这两项研究
也给了我们一个非常重要的提示
就是RBD是一个非常重要的
中和靶点
如果能有抗体可以阻断
RBD与受体的相互作用
那么这个抗体
就可以在病毒感染的第一步
起到一个抗病毒的活性
所以我们选择RBD
作为一个抗原
来筛选我们的中和抗体
为了分离到人源的中和抗体
首先我们解决了第一个
关于抗原的问题
那么紧接着
我们面临的第二个问题
如何来分离这些中和抗体
目前分离人员的中和抗体
主要包括以下四种技术
B细胞永生化技术
展示技术
转基因小鼠技术
以及从病人的B细胞内
直接扩增抗体的技术
目前最常用的
主要包括的是展示技术
和单个B细胞的技术
当然如果我们能从
MERS感染者的B细胞内
直接扩增到抗体
这当然是非常理想的选择
但是基于生物安全
以及样品采集的难易程度来看
目前这种方案并不可行
所以结合本实验室的优势
我们选择采用酵母展示技术
来进行人源单克隆抗体的分离
本实验室所保存的酵母展示的
抗体文库
是来源于58个正常人的B细胞
我们从B细胞里
扩增出抗体的重链和轻链的
可变区
通过随机配对之后
构建在酵母表达载体上
这张图所显示的
就是酵母表面展示的
是抗体的可变区scFv
并且C端带有了一个
可检测其表达的
cmyc标签
我们就用这样一个
酵母展示的抗体库
继续进行我们的研究
我们的研究主要包括三个部分
第一部分是分离和鉴定
针对MERS冠状病毒的中和抗体
第二部分是对抗体进行优化
第三部分是构建双特异性的抗体
首先我们从第一部分
分离和鉴定这些抗体开始
前面我们已经提到
我们是利用RBD蛋白
作为抗原
从酵母展示的抗体文库中
筛选单克隆抗体
其基本原理是左图所示这样
我们将带有标记的RBD蛋白
与库容量为10的九次方的
抗体库孵育
然后通过双荧光的分选
得到与RBD特意结合的
酵母scFv单克隆
整个分选过程
包括两轮的MACS分选
和两轮的FACS分选
从这张图我们可以看出
经过两轮的MACS分选之后
酵母阳性克隆百分比
大约为0.77左右
然后再经过两轮的流式分选
这群细胞得到明显的富集
阳性率已经达到了24.72%左右
随后我们将这一群阳性细胞
分选出来
经过测序和分析
我们最后得到了14个
与RBD蛋白
可以特异性反应的酵母单克隆
这14个单克隆
与RBD结合的能力
在流式水平上
会表现出有强有弱的区别
这张表显示的是
这14个单克隆抗体的序列分析
这里边包括
他们所属的胚系
以及他们和胚系基因相比
突变率的变化
我们知道我们这个抗体库
是来源于正常人的B细胞
所以从图中我们大致可以看出
它们的与胚系的突变率
相对较保守
都在90%以上
我们拿到了这14个
识别MERS RBD的单克隆抗体
首先我们最关心的第一个问题是
它们是否具有中和活性
于是呢
我们将他们重链的可变区
重链和轻链的可变区
分别扩增出来
然后利用左图所示的
这样一种线性表达的方式
将轻链
将重链和轻链的可变区
与恒定区
以及真核表达的启动子融合
形成了一种
这样抗体线性表达载体
然后我们将这个线性表达载体
重链轻链配对
转染细胞
收取了细胞上清之后
直接进行中和抗体的
中和活性的初筛
这张右图所示的
就是中和活性初筛的结果
通过假病毒实验
我们可以发现
在这14个抗体当中
有3个抗体表现出了中和活性
分别是MERS-4 MERS-27
和MERS-36
为了精确的比较
这三个抗体的中和活性的强弱
以及精确的计算出
它们中和的IC50
我们将这三个抗体表达纯化
精确定量之后
首先还是进行假病毒的中和实验
左图所示的
就是假病毒中和实验的结果
我们可以发现
这三个抗体在假病毒的水平均
IC50均达到了纳摩尔级别
同时MERS-4抗体
它的IC50是最好的
能达到0.37个纳摩尔
另外两个抗体分别是
MERS-27是63.95个纳摩尔
而MERS-36是112.4个纳摩尔
在香港大学的协助之下
我们同时在活病毒水平
检测了这三个抗体的中和活性
活病毒的结果
如这张图所示
基本趋势与假病毒是相同的
MERS-4抗体是最好的
MERS-27其次
而MERS-36是中和活性最弱的
我们知道病毒感染细胞
除了游离的病毒颗粒
可以直接进入细胞之外
还有另外一种更加有效的方式
是病毒在细胞和细胞之间的
直接转移
这种转移主要是通过
细胞和细胞的融合而实现
所以为了验证我们的抗体
是否有阻断这一过程的功能
我们将COS7细胞
分别转染病毒的膜蛋白
和受体基因
随后将这两种细胞混合
他们之间会发生细胞的融合
形成这种合胞体
当我们把抗体加入之后
结果如右图所示
MERS-4抗体可以完全的阻断
这样一个过程
在显微镜下观察
与阴性对照差不多
而另外两种抗体
虽然也有阻断效应的功能
但是远远不及4号抗体
仍然可以观察到
部分合胞体的形成
以上的中和实验
以及这个合胞体的实验
都是在细胞的水平
验证了这三个抗体的中和活性
那么我们接下来想知道
它们发挥这些功能的分子机制
是什么
由于我们的这三个抗体
是用RBD蛋白作为抗原
筛选得到的
所以我们首先推测
它们发挥中和作用的机制
是通过阻断病毒与受体的
相互作用而实现的
于是我们将标记之后的
RBD蛋白
与表达DPP4受体的细胞
共16:40
通过流式我们可以检测到
它们之间的结合
如下图这种
这个橙线所示
是RBD与DPP4结合之后
所以检测到的
当我们把抗体加入到
这个反应体系中
我们可以看到
随着抗体浓度的增加
MERS-4抗体阻断它们俩结合的效应
是逐渐增强的
并且在最高浓度
330个纳摩尔的时候
MERS-4抗体
可以完全的阻断
它们两个的相互作用
而MERS-27抗体这种阻断效应
相对较弱
在最高溶度的时候也有
也只有中等程度的阻断
而MERS-36抗体阻断效应
则非常微弱
可以说几乎观察不到
阻断效应的存在
这个阻断效应的强弱
与抗体的中和活性是基本吻合的
但是MERS-36抗体
它的阻断效应如此微弱
可是它却具有中和活性
所以我们推测
可能它除了阻断病毒与受体
相互作用之外
还存在其他的中和机制
既然抗体可以与受体
竞争结合RBD
那么在亲和力方面
这些抗体是否也有优势呢
我们通过SPR实验发现
MERS-4抗体与RBD的亲和力
比受体与RBD的亲和力
高大约45倍左右
而MERS-27号与RBD的亲和力
与受体在同一个数量级
但是我们意外的发现
中和活性最差的
MERS-36号抗体
它的亲和力是三个抗体当中
最好的
能够达到6.32乘以
10的负10次方的级别
我们知道一个抗体
要发挥很好的功能
除了与亲和力有关系外
还有另外一个非常重要的因素
就是它识别的表位
所以为了回答这个问题
我们继续进行抗体
识别表位的分析
王新泉老师实验室
在解析受体与RBD复合物的
晶体结构中
鉴定出了14个RBD上的
氨基酸位点
这些位点是RBD与受体
相互作用的关键位点
我们将这14个突变体
包装成假病毒
进行中和实验
经过分析中和实验中
IC50的变化
我们将它总结于这张表
我们可以发现其中有三个点
455 513和542
对MERS-4抗体的中和活性
影响较大
而另外有四个点
455 506 510和513
对MERS-36抗体中和活性影响较大
但是这些点都没有发现
对MERS-27抗体的中和活性
有影响
很有可能这个抗体
识别的表位
不在这个相互作用的平面上
我们将对MERS-4和MERS-36
抗体影响较大的几个点
在RBD蛋白上标示出来
这些点可能就是抗体识别的
RBD上的区域
从图中我们可以看出
MERS-4识别的区域
与DPP4和RBD相互作用的区域
有很大程度的重叠
所以这结果
从表位方面解释了
为什么MERS-4抗体
能完全的阻断受体与病毒
相互作用
而MERS-36抗体识别的位置
明显的发生了偏移
它并不在这个DPP4
与RBD相互作用的平面
而在这个边缘的位置
所以MERS-36的亲和力最高
但是它的中和活性却是最差的
主要是因为它识别的表位
有偏差
虽然在假病毒的中和实验中
我们没能鉴定出
针对MERS-27抗体有影响的
关键的氨基酸位点
但是我们与王新泉老师实验室的
俞小娟同学合作
成功的解析了MERS-27
与RBD的复合物的晶体结构
如左图所示
从这个晶体结构中
我们可以看出MERS-27
识别的表位
主要是位于DPP4与RBD
相互作用平面的后方
所以它的中和机制
也主要是通过阻断DPP4
与RBD的相互作用
但是由于它的角度有偏差
所以它不能完全阻断
这种相互作用
它的中和活性
要比MERS-4抗体较弱
在这个结构中
我们同时还鉴定了MERS-27识别的
关键的氨基酸位点
是535 536和539三个点
我们通过假病毒的侵染实验
证明了这三个点对假病毒
进入细胞也是有非常大的影响
同时又通过假病毒中和实验
证明了这三个点
的确是对27号抗体
完全的不敏感
是属于27号抗体的逃逸株
通过点突变的实验
我们大致确定了MERS-4抗体
识别的表位
就是图中这个橙色所标示的
同样通过结构生物学的分析
我们解析了MERS-27号抗体
识别的表位
我们换一个角度来观察
会发现MERS-27号抗体
识别的表位
与MERS-4号识别的表位
是两个
是RBD上两个不同的区域
所以基于这样一个发现
我们将这两个抗体联合在一起
做假病毒的中和实验
结果如这张图所示
当我们联合使用
两种抗体的时候
它们可以表现出轻微的协同效应
并且这种协同效应
随着抗体浓度的增加
而逐渐减弱
这一发现对将来抗体临床的应用
具有非常重要的指导意义
我们分离的三个中和抗体
主要是识别MERS的RBD
所以我们将目前已经分离的
病毒株的RBD序列
做了个对比
发现具有很高的保守性
说明目前病毒在这一区域的突变
是比较低
这一特征有利于我们的抗体
将来适用于不同的临床病毒株
在这一部分的工作中
主要就是利用MERS RBD蛋白
作为抗原
筛选到了三株中和抗体
分别是MERS-4 MERS-27
和MERS-36
通过机制研究我们发现
它们主要是通过
阻断病毒与受体的相互作用
而发挥抗病毒效应
当然还有另外一个抗体
MERS-36
我们并没有完全研究清楚
它为什么在阻断效应
如此微弱的情况下
仍然具有中和
同时通过表位的分析
我们发现两个最好的抗体
MERS-4和MERS-27
是识别RBD上不同的区域
当我们联合使用这两种抗体
它们在假病毒的水平
可以表现出轻微的协同效应
在第一部分的工作中
我们通过突变假病毒的中和实验
大致确定了中和活性最好的
MERS-4抗体的识别表位
但是我们更希望
能够通过结构生物学的手段
来精确的解析它的表位
目前MERS-4抗体有一个很重要的
很重要的影响因素
就是它的表达量
低于抗体的表达的平均水平
这一个缺陷
不利于结构生物学的研究
以及将来的临床应用
所以为了能继续后续的研究
我们首先要解决
这个抗体表达量的问题
于是就有了第二部分工作
对MERS-4抗体进行优化
我们知道抗体是由
重链和轻链组成
首先我们第一个要解决的问题
就是要知道
它表达量的低
是由于重链导致的
还是由于轻链导致的
我们将MERS-4的轻链
与另外一个表达量很高的
抗体的轻链进行互换
得到了两种嵌合体
我们发现互换之后的
MERS-4抗体它的表达量
依然很低
而另外一个表达量高的抗体
仍然表达着高表达这一个特性
所以我们觉得轻链对表达量
几乎没有影响
我们将目标锁定在
MERS-4抗体的重链上
MERS-4抗体的重链的可变区
与以下这些抗体
都来源于同一个胚系
这些抗体他们表达量
都非常高
我们将MERS-4抗体
可变区的序列
与这些抗体进行比对
是为了进一步找到
重链上限制表达量的精确的区域
从这张比对结果中
我们可以看出
4号抗体与其他这些抗体
区别最大的就是三个CDR区
一二三
而另外三个
另外四个FR区
它们则相对保守
于是我们选择与MERS-4
最相近的19号抗体
进行CDR区域的置换实验
我们依次将MERS-4抗体的
CDR1 2 3
分别置换到19号抗体上
形成了一二三
三种嵌合体
随后我们对这些嵌合体
进行表达量的分析发现
CDR1和2对表达量的影响
非常微弱
与原始的19号抗体差不多
但是当CDR3一旦置换到
19号抗体上
我们发现表达量的变化
非常的显著
同时这些嵌合体中
也只有原始的4号抗体
可以与RBD结合
其余的都不能与RBD结合
为了进一步确认以上这个结果
我们同时进行了多个区域的置换
同样是发现仅仅有CDR1和2
置换到19号抗体上
表达量的影响非常微弱
但是当CDR3加进去之后
表达量的影响则非常显著
所以我们基本上确定了
影响MERS-4表达量的因素
主要是重链的CDR3的区域
于是接下来我们就利用
分子定向进化的方法
针对这个区域
进行抗体表达量的优化
首先第一步我们要构建
MERS-4 SFV酵母定点随机
突变文库
我们通过随机引物2
将突变位点
定位于重链的CDR3区域
MERS-4抗体的重链CDR3区域
非常有特点
它只有五个氨基酸
所以我们在构建完成之后
通过测序发现
这一区域的突变率比较好
同时库容量能达到
10的6次方左右
满足我们筛选的需求
随后我们用生物素标记之后的
RBD蛋白
对这个突变库进行筛选
筛选过程总共经过了两轮的
流式分选
结果如这张图所述
上图显示的是
第一轮流逝分选的结果
我们为了能筛选到高表达
以及亲和力增高的突变体
于是我们将RBD筛选的浓度
由原来筛库的100个纳摩尔
降低到50个纳摩尔
在第一轮中显示出
它的阳性率为1.7%左右
随后我们对分选的这群细胞
随机挑取了20个克隆
进行测序
我们发现一个不好的现象
就是在第一轮测序结果中
野生型的MERS-4的氨基酸序列
占到了20条中的12条
约60%左右
所以针对这样一个情况
我们在第二轮分选中
改变了分选策略
是为了尽量减少筛选出
这些野生型的序列
我们将分选的门上移
尽量筛选强阳性的酵母群
第二轮的阳性率
大约为4.7%左右
第二轮分析完之后
我们随机挑取了50个克隆
进行测序
在这50个克隆里边
只有两个野生型的抗体序列
已经比第一轮野生型序列
野生型序列所占的比例
明显的减少
其余的48个序列里边
有重复
最后经过分析
我们得到了17个突变体
我们将这17个突变体
进行单克隆的验证
结果是这张图所显示的
为了对比出这些突变体
与野生型的差别
我们进一步将RBD的浓度
降低到25个纳摩尔
从图中这些验证的结果
我们可以看出
几乎所有的突变体
与RBD结合之后的荧光强度
都比野生型要强
所以我们开始猜测
这种荧光强度变强
可能有两个方面的原因
第一是每个突变体的表达量增加
于是它在每一个
酵母细胞表面的个数增加
随之观察到的
就是荧光强度的增加
第二个因素
有可能是突变体的亲和力增加
也会导致这种荧光强度的变强
或者是两个因素都有
所以接下来我们要从这两个方面
继续分析这17个突变体的特性
我们将这17个scFv的突变体
全部构建成全长的抗体
与MERS-4轻链配对
转染细胞之后
收取了上清
直接进行初筛和鉴定
结果如这张图所示
在上图显示的是
抗体表达量的鉴定
我们发现这些突变体
它们的表达量
都比野生型的抗体要高
绝大多数是有非常显著的变化
而有一些
只是有微弱的提高
下图显示的是突变体
与RBD结合的情况
我们发现有九个突变体
依然保持了很好的结合活性
分别是1 4 7 17 20
22 23 26和30
所以综合这两方面的因素考虑
我们将继续对这九个突变体
进行表达纯化
进行精确的中和实验
以及亲和力的测定
左图所显示的是
九个突变体的假病毒
中和实验结果
我们可以发现
这些突变体的中和活性
与野生型相比
有微弱的提高
或者是与野生型相近
集中中和活性最好的
两个突变体
分别是4号和30号突变体
它们的中和IC50
比野生型的抗体
大约低了3.6倍和6倍左右
同时我们将这九个突变体
进行精确的亲和力的测定
从这张表中我们可以看出
大多数的突变体
与野生型的突变体是
与野生型的MERS-4抗体
是在同一个数量级
有三个突变体
1 4和30
它们的亲和力KD值
大约可以达到10的负10次方
所以综合这两个结果
我们发现4号突变体
和30号突变体
既是中和活性最好的
也是亲和力最好的
所以它们与野生型相比
是最优的两个抗体
而在上一张抗体表达定量的
结果中
我们可以看到
4号突变体的表达量
明显的比30号突变体要高
于是我们将这两个抗体
大量的表达纯化发现
在实际生产抗体的过程中
这个4号的突变体
它的表达量比野生型的抗体
提高了10到11倍左右
而30号的突变体
仅仅比野生型提高了1.5倍左右
所以综合所有方面因素考虑
4号突变体是我们最想要的
最理想的优化后的抗体
它既保持了亲和力中和活性
并且在表达量方面
有了大幅度的提高
提高了10到11倍
所以后续我们将针对这个突变体
继续进行结构生物学的研究
以及其他的分析
前面实验结果已经证明了
4号抗体和27号抗体
是识别RBD上不同的区域
所以我们推测
如果把这两个抗体
做成双特异性的抗体
可能在中和活性
和广谱性方面
都会有更好的表现
但是由于之前4号原始的抗体
它的表达量非常低
所以双特异性抗体
一直没能鉴定成功
但是随后我们筛选到了一个
表达量提高十倍的突变体
于是我们继续拿这个突变体
与27号构建成双特异性的抗体
我们构建了两种双特异性的抗体
一种是将4号突变体的scFv
连接在27号抗体的全长上
我们将这种抗体称为
4scFv-27
另外一种是将两者颠倒
将27号的scFv
连接在4号抗体的全长上
称为27scFv-4
随后我们将这两种
双特异性的抗体
与4号的突变体
以及27号抗体
进行假病毒的中和实验
从结果中我们可以看出
这两个双特异性的抗体
与4号突变体的中和活性相差不大
但是它们的中和活性
明显的强于27号的抗体
IC50大约相差了180倍左右
与之前的实验结果基本是一致的
这两个抗体融合
这两个抗体融合表达之后
并没有相互影响
但是我们发现它们的中和活性
与四号突变体相比
也没有较大程度的提高
可能是由于4号这个抗体
它本身的中和活性比较强
再加上一个相对较弱的中和抗体
所以提高的幅度
不是非常的明显
同时亲和力的测定结果也表明
双特异性的抗体与4号
与4号突变体的亲和力
大致相当
但是略有提高
仍然处于同一个数量级
但是它们与27号亲和力相比
分别提高了270倍和137倍
变化非常的显著
随后我们继续分析
我们在广谱性方面的变化
在之前的MERS-27
和RBD复合物的结构中
我们鉴定了两个蛋白相互作用的
三个关键的氨基酸位点
分别是535 536和539
这三个点的突变假病毒
对MERS-27抗体是完全不敏感的
于是我们拿
这两个双特异性的抗体
继续进行假病毒中和实验
结果是这张图所显示的
我们发现双特异性抗体
对535 536和539均能保持有
较高的中和活性
但是这三个突变体
对27号抗体
都是完全不敏感的
但是对于不同的突变株
这两个双特异性抗体的
IC50之间会略有差异
这一结果说明了
双特异性抗体的广谱性
与原始的27号抗体相比
有了较大幅度的提高
虽然目前我们只通过结构生物学
鉴定了对MERS-27抗体
完全逃逸的3个突变株
我们还没有找到针对4号抗体
完全逃逸的突变株
但是随后通过结构生物学的
继续分析
我们相信会找到这些关键点
而且我们也推测
这两个双特异性的抗体
对这样一些点
也同样会具有中和活性
在将来MERS冠状病毒
复制进化的过程中
如果这些点发生了突变
原始的抗体不能对它保持中和
那么双特异性抗体
也会成为很好的补充
在这一部分的工作中
主要包括两个方面
通过分子定向进化的方法
对MERS-4抗体的表达量
进行优化
我们成功的筛选到了一个突变体
它与原始的抗体相比
表达量提高了10倍左右
同时我们将这个突变体
与27号抗体
构建成双特异性的抗体
它可以中和对27号抗体
完全逃逸的突变株
在广谱性方面
得到了明显的提高
在背景介绍中
我们提到了目前我们迫切的需要
有效的疫苗和治疗手段
来预防和控制MERS的疫情
于是我们就分离了中和抗体
那么中和抗体对疫苗
对疾病的控制
又会起到怎样的作用呢
在本研究中
我们已经通过大量的体外实验
证明了我们分离到的
这些抗体的有效性
那么下一步研究
需要用动物模型
继续进行体内的相关评估
我们可以将MERS-4的突变体
MERS-27
以及双特异性的抗体
在体外进行大量的表达纯化
随后在人源化的小鼠
以及恒河猴体内
进行动物保护实验
同时评估我们的抗体
对已经感染的个体
是否具有治疗效果
或者是对尚未感染的个体
是否具有预防感染的作用
在动物体内评估了
它们的有效性和安全性之后
当然我们最终的目的
是希望能够推向临床
为疫情严重的MERS感染者
提供一条快速有效的
特异性的治疗途径
目前MERS在韩国的疫情非常严重
新发的感染
每天都在不断的增加
中和抗体对高危人群的保护
同样是一个
我们需要
急需要解决的问题
所以面对这一现状
我们正在积极的进行动物实验
为将来的临床应用
做充分的准备
对于人群持续性的保护
疫苗是另外一个
非常有效的手段
中和抗体的分离
对疫苗的设计
同样是具有指导意义
目前已经有研究小组
用RBD蛋白作为抗原免疫小鼠
能够在小鼠体内
诱导出中和抗体
但是我们从我们的筛选结果
可以看出
我们筛选到了14个
可以与RBD结合的抗体
仅仅只有3个抗体
具有中和活性
说明在RBD蛋白上
还有很多非中和的表位
这些非中和表位区域的存在
对于这个蛋白
在体内诱导中和抗体
其实是不利的因素
所以我们从受体与RBD
相互作用的这个结构可以看出
真正与受体相互作用的RBD上
是四个beta折叠
以及周围loop形成的
这样一个平面
同时我们通过对我们抗体
识别表位的分析也发现
我们的抗体基本上
都是位于这个平面
其中最好的4号抗体
与这个平面有非常大
非常大程度的重合
所以我们想如果
我们拿另外一个支架型的蛋白
与这样一个所谓的表位疫苗
进行融合表达
通过这样一种修饰
再将这个RBD蛋白去免疫
可以它会在体内诱导更强的
中和抗体
同时我们还可以采取
另外一种策略
将RBD蛋白上
一些非中和表位
通过糖封闭的形式
将它们进行封闭
只暴露我们想要的这个区域
这样经过修饰的一个RBD蛋白
再去免疫小鼠
可能会比之前
这个原始的RBD蛋白
诱导出更强的中和抗体的反应
最后感谢我的导师张林琦教授
五年以来对我的悉心指导
以及我们合作的王新泉教授
在课题上给予的帮助
还有实验室的史宣玲老师
在各个方面的指导
还有香港大学的郑博健教授
和袁国勇教授
在活毒方面
给予的支持
以及四川大学华西医学院
武永康老师
对于自身抗体检测实验的支持
还有实验室其他的同学
以及已经毕业的师姐
当然还要感谢在座的各位老师
能够在百忙之中抽出时间
参加我的毕业答辩
谢谢大家
-化工系-侯瑞君
--答辩人侯瑞君简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-化工系-靖宇
--答辩人靖宇简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-化工系-申春
--答辩人申春简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-热能系-周会
--答辩人周会简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-航院-李京阳
--答辩人李京阳简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
--导师点评
--个人感言
-土木系-安钰丰
--答辩人安钰丰简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-机械系-刘向
--答辩人刘向简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-机械系-白鹏
--答辩人白鹏简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-自动化系-黄高
--答辩人黄高简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-自动化系-江奔奔
--答辩人江奔奔简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-自动化系-杨霄
--答辩人杨霄简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-自动化系-王圣尧
--答辩人王圣尧简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-交叉信息学院-顾钊铨
--答辩人顾钊铨简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
--导师点评
--个人感言
-水利系-武明鑫
--答辩人武明鑫简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-微纳电子系-田禾
--答辩人田禾简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-工程物理系-付明
--答辩人付明简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-工程物理系-刘飞翔
--答辩人刘飞翔简介
--论文摘要
--答辩陈述
-材料学院-李洒
--答辩人李洒简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-医学院-江力玮
--答辩人江力玮简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-医学院-左腾
--答辩人左腾简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果
-法学院-王一超
-- 答辩人王一超简介
--论文摘要
--答辩陈述
--问答及答辩结果