答辩陈述在线视频

我们进行第二个答辩环节

第二个同学叫左腾

首先由导师介绍左腾同学的

基本情况

左腾同学是1988年6月

出生在湖北省武汉市

2010年毕业于中国科学技术大学

生物学专业

获得学士学位

2011年通过了清华大学

北京大学和北京生命研究所的

联合培养项目进入

进入我的实验室学习

在过去的几年里

博士生培养期间

达到了培养方案所要求的

全部的学分

并且也通过了博士生的资格审查

也发表了相应的文章

在外审的评审过程中

三位老师都给予了较大

或者是优秀的评审结果

今天进行博士论文答辩

介绍完毕

好 谢谢 这个和前面的同学一样

这个左腾同学报告

你博士论文的时间是30到45分钟

各位老师各位同学

上午好

欢迎参加我的毕业答辩

我博士期主要工作

是对高致病性禽流感

H5N1康复者体内

针对血凝素蛋白的抗体反应

进行结构与功能的分析

对于流感我们都非常熟悉

因为我们每个人都患过流感

这是一种急性的呼吸道传染病

其主要症状包括头痛发烧

肌肉酸痛咽喉肿痛

咳嗽 流鼻涕等

流感的病原体是流感病毒

这种病毒不仅可以感染人

还可以感染鸟类

和其他一些哺乳动物

因此流感的传播范围非常广

从分类上 流感病毒

可以分成甲型流感病毒

乙型流感病毒和丙型流感病毒

根据病毒表面血凝素蛋白HA

与神经氨酸酶NA的

抗原性不同

甲型流感病毒还可以

进一步分成

不同的血清型

如H1N1 H3N2 H5N1 H7N9等等

目前已经鉴定的血凝素蛋白

有18种不同亚型

神经氨酸酶有11种不同亚型

假如他们能够任意组合

则会产生近两百种不同的

流感亚型

从宿主分布上看

野生水鸟是绝大多数

甲型流感病毒的天然宿主

H1到H16都能从野生的

水鸟中检测到

另外H17和H18是近几年

从蝙蝠中分离得到的

在所有这些亚型当中

目前已经确认能够感染人的亚型

包括H1H2H3H5H6H7H9和H10

历史上曾爆发过多次流感大流行

其中最为著名的就是1918年的

西班牙大流感

总计造成了五千万人的死亡

最近的一次流感大流行

是2009年的猪流感

这场流感影响了全世界

200多个国家

造成了一万八千多人的死亡

从这张表我们还可以看到

所有这些流感大流行

都是由甲型流感病毒造成的

所以问题来了

哪一种流感亚型会引起

下一场流感大流行

国内外的很多研究者都认为

高致病性禽流感病毒H5N1

具有引起下一场

流感大流行的可能

该病毒主要在

主要在鸟类和家禽中传播

它致病性强 致死率高

因此被称为高致病性禽流感病毒

该病毒偶尔也会传染到人

引起严重的症状甚至死亡

从2003年至今

WHO的统计数据显示

世界范围内人感染高致病性

禽流感病毒的病例数

已达700多例

其中死亡病例为400多例

致死率高达60%

因此高致病性禽流感病毒

被认为是当前公共健康

面临的严重威胁

为了进行相应的防控

我们需要提前储备流感疫苗

和治疗性抗体

那么如何才能研发

高效的流感疫苗

和治疗性抗体呢

要回答这个问题

首先我们需要了解流感病毒的

生物学背景

流感病毒是一类单股负链

RNA病毒

这是甲型流感病毒的结构示意图

从图上可以看到

该病毒具有包膜结构

包膜上有三种蛋白

血凝素蛋白HA神经氨酸酶NA

与M2离子通道

包膜内部是由M1基质蛋白

组成的病毒衣壳

衣壳内包裹着病毒的基因组

该病毒的基因组

是由八条RNA片段组成

每一条RNA片段可以编码

一到两个蛋白

这张图显示了流感病毒的

生活周期

病毒首先进入宿主细胞

将基因组释放到宿主细胞

接着病毒基因组进行转录和复制

合成新的病毒蛋白和基因组

然后包装形成新的病毒颗粒

离开宿主细胞

之前的研究结果表明

血凝素蛋白HA

在病毒进入细胞的过程中

发挥了重要作用

接下来我将介绍HA的

结构与功能

HA是一类同源三聚体糖蛋白

每一个HA单体包括两个亚基

HA1和HA2

这是HA的包外区的晶体结构

从结构上HA可以分成两部分

头部和躯干部

其中头部是由HA1的

中间区域组成

主要包括两个结构域

受体结合结构域

和退化的酯酶结构域

在受体结合结构域上

130-loop 190-helix

220-loop形成一个开放的

口袋结构

这个区域就是受体结合区域

receptor binding site

躯干部是由HA1的N端C端

以及整个HA2组成

主要包括一些长的螺旋结构

和一些loop结构

HA的主要功能是

与宿主细胞表面受体结合

然后介导膜融合过程

流感病毒的受体是

细胞表面的糖蛋白

或者糖脂上的唾液酸

HA与唾液酸受体结合之后

病毒会通过细胞的内吞作用

进入到核内体

核内体的酸性环境会引起

HA发生一系列构象改变

如图所示

HA1首先从完整的三聚体结构上

解离下来

接着HA2发生翻转

将N端的融合肽

伸入到核内体的包膜

接着C端向上翻转折叠

逐步拉近病毒包膜

与核内体包膜的距离

直至使二者发生融合

由于HA在病毒

进入细胞的过程中

发挥了重要的作用

因此HA是针对流感病毒的

中和抗体的主要靶点

这些抗体可以通过阻断

HA与受体结合

或者是抑制HA的构象改变

从而中和流感病毒

之前的很多研究结果已经表明

针对HA的抗体反应

在宿主抵御流感病毒的

保护性免疫反应中

发挥了重要作用

因此要研发高效的

流感疫苗和治疗性的抗体

我们需要对HA的抗体反应

进行深入的研究

结合目前高致病性禽流感病毒的

流行趋势

我课题将对高致病性禽流感

H5N1康复者体内

针对HA的抗体反应进行研究

根据这一研究目标

我们的研究工作将分三部分展开

首先我们将建立一种基于

酵母表面展示系统的

分析抗体表位的方法

接着我们将确定来自康复者的

五株单克隆抗体的表位

最后我们还将对康复者的

血清识别的表位进行分析

接下来我将介绍第一部分

研究内容

先简单介绍一下酵母展示系统

基本原理

Aga1蛋白是锚定在

酵母细胞壁上的一种蛋白

Aga2蛋白可以通过一对二硫键

与Aga1蛋白共价结合

如果将感兴趣的蛋白

通过融合表达的方式

连接到Aga2蛋白的C端

这个蛋白就被展示在酵母表面

这是酵母展示中的载体

PCTCON2

这是启动子 启动子后面连接的

依次为Aga2, HA-tag, (G4S) linker

和展示蛋白CD20

和cmyc-tag

这里HA-tag和cmyc-tag可以用于检测

蛋白的展示情况

这是整个方法的技术流程图

首先通过PCR对

目标抗原的基因进行PCR扩增

然后用DNaseI对其进行随机消化

然后通过PCR扩增

重组得到大小不同的片段

然后对这些片段进行3’端加A尾

与我们改造过的T载体连接

就得到这个抗原片段文库

然后将这个文库转化到酵母细胞

对其进行诱导表达

就可以用针对于这个抗原的

抗体对这个酵母文库进行

流式筛选

将筛选得到的细胞涂在平板上

然后从上面挑取一些

单克隆进行流式检测

最后将阳性克隆进行测序

通过序列分析和结构分析

可以确定这个抗体识别的表位

为了验证酵母展示系统

可以用于展示H5N1的HA蛋白

我们首先将HA全长克隆到

酵母展示载体

然后转化到酵母中

进行诱导表达

然后用HA重组蛋白免疫的

小鼠血清和针对小鼠的

荧光二抗对这个酵母进行了

流式染色

这里我们使用了CD20酵母

作为对照

可以看到CD20酵母表面

检测不到荧光

而展示HA的酵母表面

可以检测到荧光

表明酵母展示系统

可以用于展示H5N1的HA蛋白

接着我们就构建了H5N1HA的

抗原片段文库

一号泳道是HA全长

二号是泳道是用DNaseI

随机消化得到的片段

三号和四号泳道

是通过不同循环数的PCR

扩增重组

得到的片段

将这些片段

连接到酵母展示载体

然后电转到大肠杆菌

就可以得到这个抗原片段文库

我们通过对电转后的大肠杆菌

进行稀释涂板

估算该库的库容量为80万

我们还从该文库中

随机挑取了50个克隆进行测序

并与HA全长进行序列比对

从B图可以看到

正向和反向插入的片段

几乎各占一半

这些片段大小分布为100bps

到700bps

位置分布也比较随机

因此这个文库的构建

还是比较成功的

接着将这个文库转化到酵母中

为了验证这个筛选过程的

具有特异性

我们首先用

三份短肽免疫的小鼠血清

和单克隆抗体AVFlulgG03

对这个文库进行了筛选

这里展示的是AVFlulgG03的

筛选结果

经过两轮流式分选

文库中能够与AVFlulgG03

反应的酵母得到了明显的

富集

我们还从

第二轮分选得到的酵母中

随机挑选了一些克隆进行

流式检测

这里展示了其中五个阳性克隆的

检测结果

三份血清的筛选结果与其类似

接着我们将血清和单抗筛选的

得到的克隆进行测序

并与HA进行序列比对

可以看到这里三种颜色

表示的是三条免疫用的短肽

我们发现

三份血清筛选到的片段

都集中在对应短肽的位置

将左边这些DNA序列

翻译成氨基酸序列

然后统计HA上的每一个位点

在这些片段中出现的频率

我们就可以得到B图这些

峰图

其中峰尖所在的区域

就是这些片段的一个共同区域

我们发现三条短肽

都位于对应的峰尖区域

这与我们的预期也是相符的

另一方面之前的

研究结果表明

单克隆抗体AVFlulgG03

是识别构象表位

包括这些位点

这些位点也都在

我们筛选出来的片段中

与我们的预期相符

这些结果表明

我们这个筛选过程

是具有特异性的

我们知道抗体的表位

包括线性表位和构象型表位

在这里三份小鼠血清

是用短肽免疫的

因此血清中的抗体

主要识别线性表位

所以他们筛选出来的片段

也相对较短

大多在一百个氨基酸以内

这些片段的共同区域

也都在10个氨基酸左右

而单克隆抗体AVFlulgG03

它识别构象型表位

所以它筛选出来的片段

也相对较长

在两百个氨基酸左右

这一结果就表明

我们这个抗原文库

不仅可以用于分析线性表位

还可以用于分析构象型表位

前面我们所用的抗体

它识别的表位都比较单一

为了进一步探究

这个方法在分析复杂的

多克隆抗体反应中的可行性

我们又用HA重组蛋白免疫的

小鼠血清

对这个文库进行了筛选

这里显示的是五只小鼠

混合血清的筛选结果

如A图所示

我们分析了89条阳性克隆的序列

它们分布在整个HA上

B图是这些序列的频率统计图

从B图我们可以看到多个峰尖

接着我们以一百个氨基酸

为界限 将这些片段

分成短片段和长片段

我们假定这些短片段

都是由识别线性表位的抗体

筛选出来的

然后我们基于这些短片段的

重叠情况

将它们进一步分组

如C图所示

这些短片段可以分成

七组集中在HA上

七个不同的位置

由此我们推测

混合血清可以识别HA上

七个不同线性的表位

类似的

我们又对A小鼠的血清

进行了分析

发现A血清可以识别

HA上五个不同的线性表位

我们还对B血清进行了分析

发现B血清可以识别四个不同的

线性表位

我们将血清识别的七个表位

分别命名为P1到P7

其中P1到P5位于HA头部

P6和P7位于HA躯干部

对三份小鼠血清的筛选结果

进行比较可以发现

P2P5和P7能被三份血清识别

P1和P4只能被混合血清

和A血清识别

P6只能被混合血清和B血清识别

而P3则只能被混合血清识别

这表明即使对于同一个免疫原

不同的小鼠个体产生的抗体反应

也是有差异的

另一方面由于混合血清

包括A血清和B血清

那么从理论上讲

A血清和B血清识别的表位

也能够被混合血清所识别

而我们的结果也正好

证实了这一推测

我就表明我们这个抗原文库

可以用于分析复杂的

多克隆抗体反应

而且这个也证明了该方法具有

较好的稳定性和灵敏度

对这一部分研究结果

进行一个总结

我们建立了一种

基于酵母展示系统的

分析抗体表位的方法

这个方法可以用于分析

线性表位和构象性表位

也可以用于研究单克隆反应

和多克隆抗体反应

最后利用该方法

我们对HA重组蛋白免疫的

小鼠血清进行了分析

确定了HA上七个不同的

线性表位

方法建立好之后

我们就开始对

康复者体内针对HA抗体反应

进行研究

首先介绍一下这些抗体的来源

在2007年深圳第三人民医院

周伯平课题组

在《新英格兰医学杂志》上

报道了他们利用H5N1的

康复者血清成功治愈另一位

H5N1感染者的临床病例

在该病例中

恢复期血清的提供者是

来自安徽省的一位康复者

接受血清治疗的是一位

来自深圳的病人

随后中国CDC梁米芳老师课题组采集了

安徽病人的PBMC

然后构建了噬菌体展示的

抗体文库

并从文库中分离得到

两株针对H5N1的中和抗体

AVFlulgG01和AVFlulgG03

再后来 上海巴斯德所

周保罗课题组

采集了深圳病人的PBMC

然后利用B细胞永生化的技术

分离得到了三株针对H5N1的

中和抗体 65C6 3C11和100F4

拿到这些抗体之后

我们首先利用17株来自

H5N1不同分支的假病毒

对这五株单克隆抗体的中和强度

和广谱性进行了评价

如这张表所示

在五株单克隆抗体中

65C6和100F4具有最好的

中和强度和广谱性

它们能够中和除了这个

Clade 7.1之外的

所有的假病毒

其平均IC50值

为0.012微克每毫升

和0.031微克每毫升

AVFlulgG01与65C6和100F4的

中和广谱性相同

不过其中和强度略差

平均IC50值为3.25微克每毫升

3C11和AVFlulgG03的中和广谱性

不如前面三株单克隆抗体

不过AVFlulgG03

是五株单克隆抗体当中

唯一能够中和这个clade7.1

两株假病毒的抗体

这个结果就提示

这五株单克隆抗体

有可能识别不同的表位

接着我们对它们表位进行分析

我们首先用这五株抗体

对前面构建的抗原文库

进行了筛选

这是筛选结果

可以看到

五株抗体筛选的片段

都位于HA1区域

而且这些片段都非常长

通过对它们的比对分析可以发现

51到260是这五株抗体

共同识别的最小区域

位于HA的头部

根据前面的经验我们推测

这五株抗体应该都是识别HA

头部的构象型表位

为了进一步确定它们识别表位

我们又以51到260为模板

通过易出错PCR的方法

构建了一个随机点突变文库

然后利用这些抗体

对文库进行筛选

得到不能与这个抗体反应的

突变体

以AVFlulgG01为例

我们利用AVFlulgG01

和针对cmyc的抗体

对这些酵母进行流式染色

可以看到在未分选的文库中

不能与AVFlulgG01结合的酵母

所占的比例为0.19%

通过三轮流式富集之后

该群细胞的比率上升到20.16%

另外四株抗体的筛选结果

也与之类似

接着我们将五株抗体筛选得到的

酵母克隆进行了测序

并与原始的序列进行了比对

就可以确定每个单抗

筛选出来的突变克隆

然后根据HA的晶体结构

我们将这些突变克隆分成两组

覆盖在蛋白内部的位点

和暴露在蛋白表面的位点

接着我们将暴露

在蛋白表面的位点

用红色标示在HA的晶体结构上

由于一个表位所包括的氨基酸

在空间上他们是彼此临近的

所以我们就可以大致确定

这五株单抗的表位

在这里我们可以看到

65C6 3C11和AVFlulgG01

它们识别的表位比较接近

都位于这个receptor binding site的背面

然后AVFlulgG03的表位

恰巧位于这个receptor binding site

100F4识别另外一个不同的表位

位于这个65C6表位的斜下方

接着我们还根据前面的

这个表构建了一系列的

这个突变假病毒

然后用这些突变假病毒

对这五株抗体的中和活性

进行了评价

可以看到有14株突变假病毒

可以对五株抗体的中和活性

产生影响

这就进一步验证我们前面

通过随机点突变文库

确定的表位是比较准确的

为了更准确和直观的分析

这个抗体的表位

我们决定进一步

解析这个抗原抗体复合物的

晶体结构

于是我们同清华大学

生命学院王新泉教授

开展了这部分研究工作

我们采取的策略是用HA的头部

与抗体的Fab区

形成复合物

然后进行结晶

所以我们开始需要选择HA的

头部片段

在前面用抗体筛选

抗原文库的过程中

我们得到了大量包括HA头部的片段

所以我们首先从这些片段里

根据它们的长短

挑取了八条代表性的片段

然后用流式检测这些片段

与三株识别不同表位的抗体

65C6 AVFlulgG03和100F4的

结合情况

最后从这八条片段中

我们最终挑取了F45-268

用于后续的结构研究

因为它能够与三株抗体

有较强的反应

而且它的长度也是相对较短的

接着王新泉老师实验室的

孙建峰利用杆状病毒系统

表达了F45-268

为了确定这个蛋白具有

正确的构象

他首先用这个蛋白单独结晶

并且析出了其晶体结构

A图就是F45-268的晶体结构

B图是将F45-268与HA全长

进行结构比对的结果

可以看到F45-268具有正确的

空间构象

接着孙建峰就利用F45-268

分别与65C6 AVFlulgG03

和100F4的Fab

形成复合物然后进行结晶

并最终都拿到了它们的

高分辨率晶体结构

这是65C6的分析结果

如A图所示

65C6主要通过重链

与这个抗原结合

将这个复合物的晶体结构

重叠到HA的晶体结构可以看到

65C6结合在HA的顶端

通过对这个复合物晶体结构

进一步分析我们可以确定

65C6的表位

与我们前面确定表位是一致的

D图显示了65C6表位

所包括的全部氨基酸

其中红色标记的是

通过假病毒中和实验

确定的表位

这是AVFlulgG03的分析结果

如A图所示

AVFlulgG03也是主要通过

抗体的重链与抗原结合

将这个复合物的结构

重叠到HA的晶体结构可以看到

AVFlulgG03也是识别HA的顶端

进一步分析可以发现

AVFlulgG03的表位位于

这个受体结合区域

也与我们之前的分析结果一致

D图是展示了AVFlulgG03

表位所包括的全部氨基酸

这是100F4的分析结果

如A图所示

100F4的重链和轻链

都参与了与抗原的结合

将这个复合物晶体结构

重叠到HA上可以看到

100F4结合的位置

在HA头部偏下的位置

C图展示了100F4的表位

也与之前

我们通过其他方法

确定的表位一致

D图显示了100F4表位

所包括的全部氨基酸

到这里我们已经

已经确定了H5 HA头部的

三个中和表位

为了明确H5的头部

是否存在更多的中和表位

我们又阅读了大量的相关文献

并对这些已经报道的表位

进行了总结

如这张表所示

可以看到这里大部分的表位

都是通过筛选病毒逃逸株

来确定的

只有一株抗体H5M9

是通过晶体结构确定其表位的

所以我们首先将H5M9的表位

与我们确定的三个表位

进行比较

如A图和B图所示

H5M9识别另外一个不同的表位

位于HA头部的底端

与这个100F4的表位

有几个氨基酸的重叠

接着我们又进一步比较了

通过其他方法确定的表位

将其他方法确定表位

与这四个表位进行了比较

如C图所示

这里不同颜色显示的

是这四个表位

而通过其他方法确定表位

都用这个星号

表示出来的

从这张图我们可以看到

通过结构以外的方法确定的表位

都包括在我们这四个表位

或者是在这四个表位附近

根据这一分析结果

我们就定义了H5头部的

四个主要的抗原区域AS1 AS2 AS3和AS4

其中AS1和AS2位于HA的顶端

它们呈一个背对的位置关系

AS2正好位于受体结合区域

AS3在AS1和AS2的下方

AS4在AS3的下方

位于这个HA头部的

底端位置

对这部分研究结果进行总结

我们首先分析了五株

单克隆抗体的中和强度和广谱性

并确定了它们的表位

我们还确定了65C6

AVFlulgG03与100F4

与这个HA头部的复合物的

晶体结构

最后我们还定义了H5HA头部的

四个不同的抗原区域

接下来我们将

对康复者的血清识别的表位

进行分析

同样的我们首先也对两份血清的

中和强度和广谱性

进行分析

从这张表可以看到

两份血清都能够中和

所有的这17株假病毒

比前面五株单克隆抗体

具有更好的广谱性

另一方面我们也发现

血清对于不同的假病毒

它的中和强度是不一样的

以SZ06血清为例

SZ06对这株假病毒

它的中和强度是最弱的

ID50值为225

SZ06对于广西这一株

假病毒的中和活性最强

ID50值为一万六千九百多

两者相差了近80倍

接着

我们用两份血清对抗原文库

进行了筛选

如左图所示

两份血清筛选的片段

都可以分成两组

一组片段位于HA1区域

这些位于HA1区域的片段

都比较长

与前面用单克隆抗体

筛选出来的片段比较相似

另一群片段位于HA2

这些片段相对较短

从这个结果我们可以看到

血清中包括针对于

HA头部的抗体

也包括针对于HA躯干部的抗体

前面背景中我们也讲到

针对HA头部的抗体

和躯干部的抗体

都有可能中和流感病毒

那么接下来我们就想

进一步探究这个血清中的

中和抗体的主要靶点

为了回答这个问题

我们采用了嵌合体假病毒的

分析方法

该方法原理如下

首先根据血清对不同假病毒的

中和活性挑选两株假病毒

非敏感株和敏感株

然后对这两株假病毒的

HA头部和躯干部进行替换

得到两株嵌合体假病毒

最后通过比较血清

对这四株假病毒的中和活性

我们就可以判断血清中

中和抗体的主要靶点

这是我们的实验结果

以这个结果为例

对于SZ06而言

广西04这一株假病毒

是敏感株

Hong Kong07这一株

假病毒是非敏感株

对这两株假病毒进行头部

和躯干部替换

可以得到两株嵌合体假病毒

比较SZ06

对这四株假病毒的中和曲线

可以看到

广西04与广西head+Hong Kong stem

这两株假病毒的中和曲线

比较接近

Hong Kong07与这个

Hong Kong head加上广西stem

这两株假病毒的中和曲线

比较接近

由此我们可以判断

血清对于假病毒中和活性

主要取决于HA的头部

其他三组实验结果

也与这个结果类似

由此我们得出结论

血清中的中和抗体

主要是针对于HA头部

由于前面我们已经定义了

H5HA头部的四个主要的

抗原区域

所以接下来我们还想进一步探究

这个血清中的中和抗体

是否也是针对于这四个区域

于是我们

又用突变假病毒进行了分析

前面我们已经确定有14株

突变假病毒

对五株单克隆抗体的中和活性

有影响

所以我们首先用这14株假病毒

对两份血清的中和活性

进行了分析

从这里可以看到

这四个点突变

对于AH06的血清

中和活性有影响

这两个点突变对SZ06的

中和活性有影响

由此我们推测

这两份血清中

都含有针对相应位点的中和抗体

由于这里面所用到的突变

都是从这个随机突变文库中

筛选得到的 属于人工突变

接着我们还想进一步探究

这个流感病毒的自发突变

是否也能够影响这个血清的

中和活性

于是我们又根据不同流感病毒的

中和敏感度和序列

又重新构建了两个三点突变

如这个结果所示

这两个三点突变也同样的

都能够影响AH06

和SZ06的中和活性

这张表是对上面这些结果的

一个总结

从这张表可以看到

位于这四个抗原区域的点突变

单点突变或者是多点突变

确实能够影响血清的中和活性

由此我们认为这个血清中的

中和抗体确实主要是针对于

这四个表位的

对这一部分的研究结果

进行一个总结

我们分析了

康复者血清的中和强度

和广谱性

并对其识别的表位进行了分析

到这里我们的研究结果

已经全部汇报完了

那么我们这个研究

它有什么意义呢

我想从三个方面进行讨论

第一从这个技术方面

我们建立一种基于酵母表面

展示系统分析抗体表位的方法

包括随机切割抗原文库

和随机点突变抗原文库

这个方法可以用于分析线性表位

和构象型表位

也可以用于分析单克隆抗体表位

和多克隆抗体表位

另外从疫苗设计的角度

传统的流感疫苗都是基于

完整的流感病毒

后来随着大家对于

针对于流感病毒的保护性

抗体反应的认识的逐步加深

后面出现了重组的HA

亚单位疫苗

同传统疫苗相比

该亚单位疫苗它的靶向性更好

而且生产也更方便

在本研究当中

我们发现血清中

康复者血清中

包括针对于HA头部

和躯干部的抗体

但是中和抗体主要是针对于

HA头部

由此我们可以在HA重组

亚单位疫苗的基础上

进一步集中目标

根据HA头部设计流感疫苗

通过查阅文献我发现

目前已经有一些研究小组

正在采用这一策略

而且已经取得了不错的效果

另外我们还确定了H5HA头部的

四个主要的抗原区域

因此在将来的

在将来疫苗设计

我们还可以根据

这四个抗原区域

进一步设计这个表位疫苗

最后从抗体治疗角度

本研究中

我们对五株单克隆抗体

进行了结构与功能的分析

确定它们的表位

另外我们也发现

两份康复者血清

比单克隆抗体具有更好的广谱性

这就提示我们可以通过

对这个抗体进行联用

或者构建双特异性抗体

而提高抗体的广谱性

从而应对流感病毒的变异

另一方面我们也可以基于

目前的这些结果

对这些抗体进行优化

以65C6为

以65C6为例

从结构上可以看到65C6

主要是通过重链的

重链CDR3区域

与抗原结合

因此我们可以构建一个

65C6CDR3的随机突变文库

然后从这个随机突变文库中

筛选高亲和力突变

从而提高65C6中和强度

我的工作就汇报到这里

能有机会站在这里汇报

我首先必须要感谢我的导师

张林琦教授

是他给了我来清华

学习和锻炼的机会

也是他给了我全面而细致的指导

我一定不会辜负张老师的期望

争取在未来的科研道路上

取得更大的进步

我还要实验室的史宣玲老师

和刘中华老师

在我刚进入实验室

还什么实验都不会做的

史老师和刘老师几乎是

手把手的教我做实验

让我快速的掌握了各项实验技能

从而使得我的课题能够顺利开展

需要补充的是

刘老师知道

我今天答辩的消息之后

还专程从外地赶来参加

非常感谢

还要感谢

还要感谢我们实验室

还要感谢参与本课题的同学们

江力玮 左亚男 王若珂

李丹阳和罗霖

他们也为本课题做出了重要贡献

感谢清华大学生命学院的

王新泉教授 孙建峰

和刘曦师兄

他们为本课题的晶体结构部分

做出了重要贡献

感谢上海巴斯德所周保罗教授

王桂芹 胡红星 钱梦然

他们在假病毒中和实验方面

给予的巨大帮助

还要感谢清华大学化工系的

林章凛教授

和徐望晖博士

他们在文库构建方面

给予的帮助和指导

感谢中国CDC梁米芳老师

和孙丽娜博士

为我们提供了抗体

以及对于本课题的宝贵建议

感谢深圳第三人民医院

周伯平教授

为我们提供了康复期的

病人血清样本

最后还要感谢大家来参加

我的毕业答辩

谢谢大家