4.2 The enumeration of Coliforms在线视频

第二节 大肠菌群计数

大肠菌群 是指在一定培养条件下

能发酵乳糖 产酸产气的

需氧和兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌

该菌主要来源于人畜粪便

作为粪便污染指标评价食品的卫生状况

推断食品中肠道致病菌污染的可能

按照 GB4789.3-2016 共有两个方法

MPN 法和平板计数法

本次实验所需培养基 试剂 设备和材料

如上所示

其中用到的培养基有月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤

煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤

结晶紫中性红胆盐(VRBA)琼脂

此图为国标两种方法的流程示意图

这两种方法前期

对样品的稀释步骤

与菌落总数测定的稀释步骤大致相同

但注意在配制匀液时

需用过滤除菌的 1mol/L NaOH 或 1mol/L HCl

调节 pH 至 6.5-7.5 之间

下面我们先介绍第一法 MPN 法

MPN法 最可能数法

是基于泊松分布的一种间接计数方法

该法适用于大肠菌群含量较低的

食品大肠菌群计数

第一步 初发酵

对样品进行一系列 10 倍稀释后

进行初发酵试验

接种前需确认

高压后 LST 小导管中无气泡

选择 3 个适宜的连续稀释度的样品匀液

（也可选择原液） 做好标记

每个稀释度接种 3 管

月桂基硫酸盐胰蛋白胨(LST)肉汤

每管接种 1mL

（若接种量超过 1mL,则用双料 LST 肉汤）

接种时沿壁缓慢加入

避免产生气泡

注意吸取不同稀释度时

需要更换新的吸管

注意 从制备样品匀液至样品接种完毕

全过程不得超过 15 min

接种后 36±1℃培养 24±2h

若倒管内有气泡产生

进行复发酵试验

若未产气 则继续培养至 48±2h,

产气者进行复发酵试验

未产气者报告为大肠菌群阴性

实验中所用月桂基硫酸盐胰蛋白胨（LST）肉汤

其成分及制法如图所示

乳糖提供菌体细胞生长所需要的碳源

月桂基硫酸钠抑制非大肠菌群类细菌的生长

第二步 复发酵

在前面初发酵试验中产气的肉汤管

需进行复发试验进行证实

用接种环从产气的 LST 肉汤管中分别取培养物 1环

移种于煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤管中

36℃±1℃培养 48h±2h

产气者计为大肠菌群阳性

下面我们看一下复发酵试验中所用的

煌绿乳糖胆盐(BGLB)肉汤成分及制法

乳糖提供菌体细胞生长所需要的碳源

牛胆盐和煌绿抑制革兰氏阳性菌

及非大肠菌群的革兰氏阴性菌的生长

复发酵试验后 我们即可根据其确认的大肠菌群

BGLB 阳性管数 检索 MPN 表

报告每 g 或每 mL 样品中大肠菌群的 MPN 值

注意 MPN 检索表只给了三个稀释度

如改用其他稀释度

则表内数字应相应降低

或增加 10倍

例如 选取的 10^-5 10^-6 10^-7 稀释度所得

阳性管数分别为 3 2 1

查表可得对应 MPN 值为 150

但国标中稀释度与实验所取稀释度

相差 10^4 即一万倍

故最终大肠菌群 MPN 值还需乘以 10^4

第二法为大肠菌群平板计数法

大肠菌群在固体培养基中发酵乳糖产酸

在指示剂的作用下形成可计数的红色或紫色

带有或不带有沉淀环的菌落

此法适用于大肠菌群含量较高的

食品中大肠菌群的计数

大肠菌群平板计数法流程如上图所示

样品稀释方法与 MPN 法中样品稀释步骤一致

样品稀释之后按右边的流程

进行后续的接种培养 计数和报告

稀释后 选取 2-3 个适宜的连续稀释度

每个稀释度接种 2 个无菌平皿 每皿 1mL

同时取 1 mL生理盐水加入无菌平皿作空白对照

及时倒入 15-20 mL 恒温至 46℃的 VRBA 培养基

旋转平皿 使其充分混匀

待琼脂凝固后

再加入 3-4mlVRBA 覆盖平板表层

防止菌落蔓延生长

这里用到的是结晶紫中性红胆盐琼脂培养基

其成分及和制法如上所示

蛋白胨酵母粉提供碳源

氮源等促生长成分

中性红为酸碱指示剂

胆盐和结晶紫可抑制革兰氏阳性菌的生长

待琼脂完全凝固后 翻转平板

于 36℃±1℃培养 18h-24h

时间到后 即可取出平板

观察平板 进行菌落数的选择

完成培养后 取出平板 观察平板

选取计数范围梯度平板分别计典型

和可疑大肠菌群菌落数

典型菌落的特征为紫红色

菌落周围有红色的胆盐沉淀环

菌落直径为 0.5 mm 或更大

而可疑大肠菌群的菌落

直径较典型菌落小

平板菌落数的选择

选取菌落数在 15 CFU~150 CFU 之间的平板

分别计数平板上出现的典型和可疑大肠菌群菌落

最低稀释度平板低于 15 CFU 的记录具体菌落数

下面根据我们选择的平板再进行证实试验

从VRBA 平板上挑取10 个不同类型的典型和可疑菌落

注意挑取时不要挑到培养基

并且挑取时需要在背面做标记 对菌落的特征进行记录

若平板上少于 10 个菌落的则挑取全部菌落

分别移种于 BGLB 肉汤管中

在 36℃±1℃条件下培养 24h-48h 观察是否产气

若产气 则报告为大肠菌群阳性

结合我们上面的实验结果

我们来进行大肠菌群的计数报告

可以看到 第一稀释梯度的两个平行

和第二稀释梯度的平行1 的平板菌落数

均在15 CFU -150 CFU 范围内

而第二稀释度的平行2 菌落数

只有11

不在 15 CFU -150CFU 范围内

所以 n1 =2 n2 =1，d=10^-2

对于在范围内的每个平板接种

10 支 BGLB 进行证实试验后

阳性管数如表所示

将已知数据代入公式即可得出结果