4.4 脱毒苗的鉴定在线视频

大家好

通过不同脱毒方法获得的植物材料必须经过严格的病毒检测

证明其体内确实不含有要脱除的病毒

才是真正的脱病毒苗方可在生产上应用

脱毒苗鉴定的方法主要有

指示植物病毒鉴定法

抗血清鉴定法

分子生物学方法等

指示植物病毒检测法

是最早应用于病毒检测的方法

早在1929年

美国的病毒学家霍姆斯（Holmes）用感染马铃薯花叶病毒（TMV）的

普通烟叶的粗汁液和少许金刚砂混合

然后在烟叶子上摩擦

一段时间后叶片上出现了局部坏死斑

每种植物病毒都有一定的寄主范围

并在某些寄主上表现特定的症状

借此可作为鉴别病毒种类的标准

对某种或某几种病毒

即类似病原物或株系具敏感反应

并表现明显症状的植物称为指示作物

这种病毒鉴定方法就叫指示植物检测法

常用的指示植物有草本和木本两类

一种理想的指示植物具备的特质是

能快速生长具有适宜接种的大叶片

且能在较长时间保持对病毒的敏感性

易接种在较广范围内具有同样的反应

可作为病毒检测的指示植物有千日红 曼陀罗 野生马铃薯

黄花烟 心叶烟和豇豆等

用草本指示植物检测植物病毒通常采用汁液涂抹法

即通过外力在指示植物体表面如叶片

造成微小伤口使病毒从伤口进入植物细胞

引起被接种植株发病的方法

具体操作如下

被鉴定植物上取几片幼叶

在研钵中加少量水及等量

pH7.0的0.1mol/L磷酸缓冲液

研碎后用两层纱布滤去渣滓

再在汁液中加入少量的500～600目金刚砂作为摩擦剂

取汁液在指示植物叶面上轻轻涂抹轻轻摩擦

使叶面造成小的伤口进行接种

5min后用清水冲洗叶面

接种时可用手指涂抹 或纱布 或喷枪来进行

接种后将指示植物放在半遮荫

半遮蔽

温度为20℃～25℃条件下

定期观察并记录指示植物症状

根据其症状的有无即可判断待检测样品是否带有已知病毒

此外有些草本植物如草莓病毒还可以采用嫁接接种法检测

取待测植物

例如草莓幼嫩的成叶切去左右两片小叶

把中间小叶削成带有1～1.5厘米叶柄

叶柄切面成契形的接穗

同时除去指示植物上中间的小叶

在叶柄的中央部分

切一个1～1.5厘米的契形口

插入接穗包扎接合部

罩上聚乙烯塑料袋或放在喷雾室内保湿培养

若接穗染有病毒

则在接种后1～2个月

在新展开的叶片匍匐茎或老叶上出现病症

每一指示植物可嫁接2～3片待测叶片

此法可全年进行

木本植物种类较多所感染的病毒各异

所以应根据不同的病毒选择适合的指示植物

经过试验和筛选目前国际上各类植物病毒

目前国际上各类植物病毒都有一套通用的木本指示植物

木本多年生果树等植物采用汁液接种法比较困难

通常采用嫁接传染法

以指示植物作砧木被鉴定植 物作接穗

可采用双重芽接法双重切接法

双重芽接法是对苹果软枝病检测中创立的方法

是检测木本植物病毒最主要的方法

指示植物病毒检测法

指示植物病毒检测法在检测中具有观察的直观性

且要求的条件简单操作方便成本低

目前仍在广泛使用

其缺点是灵敏性差所需时间长

难以区分病毒种类不能测出病毒总的核蛋白浓度

而只能测出病毒的相对感染力

抗血清鉴定法

植物病毒是由蛋白质和核酸组成的核蛋白

是一种抗原

给动物注射后会产生一种免疫球蛋白称为抗体

抗体主要存在于血清中故含有抗体的血清为抗血清

不同病毒刺激动物产生的抗体均有各自的特异性

因此根据已知的抗体与未知的抗原

能否特异结合形成抗原抗体复合物的情况可判断是否携带病毒

由于植物病毒抗血清具有高度的专化性

感病植株无论是显症还是隐症

均可通过血清学的方法准确地判断

断植物病毒的存在与否 存在部位和存在数量等

在植物病毒血中能定性 定量的快速检测

所以抗血清法是病毒检测中最为常用和有效的检测手段之一

抗血清鉴定法要进行抗原的制备

包括病毒的繁殖 病叶研磨和粗汁液澄清

病毒悬浮液的提纯病毒的沉淀等过程

还要进行抗血清的制备包括动物的选择和饲养

抗原的注射和采血抗血清的分离和吸收等过程

病毒的抗血清鉴定法主要依据沉淀反应原理

具体有试管沉淀试验 凝胶扩散试验

免疫电泳技术酶联免疫吸附分析法（ELISA）

荧光抗体技术等检测法

下面着重介绍酶联免疫吸附分析法

酶联免疫吸附分析法

ELISA

是把抗原与抗体的特异免疫反应

和酶的高效催化作用有机结合起来的一种病毒检测技术

它通过化学的方法将酶与抗体或抗原结合起来

形成酶标记物

如通过碘酸钠将辣根过氧化物酶

和抗体球蛋白相结合形成酶标抗体

具有活性的酶标记物与相应的抗原或抗体反应形成更大的复合体

形成更大的复合体

试验结果可根据待检测样品与阴性对照的颜色差

或用酶标仪测定反应后的底物溶液在一定波长下的吸光值作出判断

从而达到检测病毒的目的

ELISA法形式多样从原理上可分为以下三种

双抗三明治法

双抗三明治法的主要步骤为

一特殊的抗体被结合固定在固体表面如微孔板上

这就是包埋抗体

加入样品使其中病毒抗原

加入样品使其中病毒抗原与特异抗体结合

未结合的洗掉这就是捕获抗原

三加入结合有酶的抗体

如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶

而未结合的洗掉

第四步加入酶作用底物

如磷酸硝基苯发生颜色反应

用酶标仪测颜色深浅其与抗原含量成正比

第二种方法间接酶联免疫法

间接酶联免疫法的主要步骤为

第一步进行点样

使样品中病毒抗原与微孔板结合

第二个加入抗原的特异抗体

使抗原与抗体结合而未结合的洗掉

第三步加入与酶结合的非特异性第二抗体

使其与一抗充分结合

未结合的则被洗掉

最后一步加入显色剂用酶标仪测颜色深浅

第三种方法斑点免疫结合法

为防止与微孔板结合的“泄漏”

和“解吸附”而发展的以硝酸纤维素滤膜

尼龙膜或其他支持物代替聚苯乙烯的酶联免疫法

由于材料便于折叠携带且结合力强

其灵敏度以及方便性均优于微孔板酶标法

此法不能通过定量测定

斑点免疫法有斑点印记法和狭线印记法

斑点免疫结合法通常是把植物组织压在硝酸纤维素滤膜上

抗原从植物组织中释放出来

并结合在膜上

通过直接的方法进行检测

或利用碱性磷酸酶标记

间接检测结合在膜上的抗原

这在实际检测中体现出了高效率

特别是当植物蛋白对ELISA检测有干扰时

斑点免疫结合技术表现出了优越性

ELISA法检测病毒具有适于测定大量样品

成本低反应结果可长期保存快捷 简便

不需要使用同位素和复杂的设备

且对人体基本无害等一系列优点

但是也存在一定的缺点

首先是抗体的制备所需时间长费时费力

其次它一次只能检测一种病毒

检测多种病毒时灵敏度降低

分子生物学方法

随着分子生物学技术的快速发展

分子生物学方法已经成为植物病毒检测的一种重要手段

并可克服抗血清鉴定法中

对无外壳蛋白的病原性

核糖核酸无法进行检测的弊端

主要包括核酸杂交技术聚合酶链式反应(PCR)技术

双链RNA(dsRNA)电泳技术 DNA微阵列技术等