体内药物分析技术——分析方法学验证在线视频

大家好 我是裴奇

来自中南大学湘雅三医院

这节课我们讲述的是

药物体内分析技术的分析方法学的验证

我们主要从两个方面来讲述

首先是我们遵循的法规

第二个是我们验证项目的名称 目的

然后评价方法及其最后的接受标准

首先来看一下我们现在遵循的法规

目前我们主要遵循的是中国药典

2015版生物样本定量分析的方法指导原则

这个指导原则它是在FDA2012版和

EMA的2010版两个版本的基础上

结合我国的实际情况颁布的

我们现在具体来看一下它底下的验证项目

第一个验证项目叫做特异性

我们也称呼它为专属性或选择性

它指的是在样本分析存在干扰的情况下

分析方法能够准确地专一的

测定分析物的一种能力

我们通过这四张色谱图来给大家做一个简单的解释

首先我们会进针空白的基质

空白基质之后我们希望在

上面这个是药物通道 这个是内标通道

希望在这两个通道里面都是没有干扰的

也就说这个线基本上是平的

然后我们进针药物溶液

在药物通道里面

它出现一个色谱峰是我们预期的

但是我们希望它在这个内标通道这个地方

是没有任何干扰的

同样当我们进内标溶液的时候

在内标通道我们需要有这样一个色谱峰

但是在药物通道里面

我们希望它是没有的

最后我们会进针空白基质

里面既含有药物又含有内标

我们通过这四张图能够评价

药物和内标 相互之间没有干扰

然后这个空白基质对于测定是没有干扰

所以通过这样四张图

能够判断我们这个方法是不是具有特异性

第二个验证的项目叫做标准曲线

标准曲线我们希望它要覆盖住

整个生物样品的浓度

因为标准曲线它是不允许外推法去计算的

但是在很多时候

药物浓度可能跨度非常大

所以这个时候我们可能就需要加做这个

叫做稀释方法学

那本身标准曲线的做法

首先它需要一个空白基质样本

然后需要空白基质加上内标的样本

最后才是空白基质和系列浓度点

这个地方系列浓度点就是浓度梯度变化

通常来说是6到8个点

它至少需要6个点

然后它的跨度通常是在100到1000倍

我们以底下这条标准曲线浓度为例

最高点是一千微克每毫升

最小的这是五微克每毫升

那它跨度范围就是200倍的跨度范围

这个跨度范围一方面取决于这个生物样本

本身的药物浓度

另一方面也取决于这个测定方法

因为这个测定方法有可能在达到

跨度500倍的时候

这个标准曲线就开始饱和了

比如响应开始饱和

所以这个时候它就没法达到我们接受的标准

接受的标准是什么

我们的标准是要求这样一个标准曲线

它在线性回归的时候

R的平方要大于0.99

而且要求它的准确度

也就是每个点的准确度要在85%到115%之间

然后最低点要在80到120之间

通常来说八个点的这样一个标曲

我们不可能保证在每次分析中

每个点都能达到我们预期的要求

所以说我们是允许它剔除的

通常允许它剔除两个点

也就说这样我们还是能够保证一条标曲

它一共是有6个点

但是通常来说我们是不能剔掉最低点和最高点

因为剔掉了最低点和最高点

这样标曲的范围就会缩窄

接着来看一下定量下限

定量下限是指在我们能够接受的

精密度和准确度的前提下

这个方法能够定量的最低的药物浓度

在这个时候它的精密度的要求是20%

准确度是要80到120之间

看一下精密度和准确度的定义

精密度主要是指在确定的分析方法的情况下

然后相同的基质 相同的浓度

在测定结果上的分散程度

通常来说我们要求它是在15%以内

这个15%是在几乎我们所有的

分析方法的验证的标准里都是一样的

除了刚刚前面提到的定量下限是20%

其它地方都是15%

准确度是指在确定的分析条件下

样本测定出来的浓度和理论浓度

或者说和真实浓度的偏差程度

通常要求落在理论值的85%到115%之间

同样这个标准也是适合所有的浓度

除了我们前面讲的定量下限

可以允许到80到120

然后具体做精密度

我们通常来说需要做批内精密度和批间精密度

批间精密度指的就是连续的三批

但是我们不能在同一天将三批样品都完成

我们至少要求它在连续两天完成

三批的批间精密度

当然你可以连续三天

或者是隔更长时间都可以

但不允许在一天内完成

那具体做精密度的时候

我们要做低 中 高三个浓度

这个浓度的设置也是有讲究的

从标点曲线的范围

比如以前的例子

1000到5微克来说

我们要求的低浓度

它是要在最低点的三倍以内

我们最低点现在是5微克每毫升

所以说我们现在低浓度可以选择15微克每毫升

这是它的三倍以内

中浓度我们选择是标曲的中间点

那我们选择就是在这个地方

150微克每毫升

而我们的高浓度要求选择标曲的上限附近

通常我们选择它的80%

那标曲最高点是1000

那我们的高浓度就是800微克每毫升

在这个地方特别要强调的

这也是新的法规上要求的

低 中 高浓度点和我们的标准曲线点

是不能重合的

怎么理解

比如说我们要求低浓度

是在定量限的三倍以内都可以接受

我们现在定量限是5

那我们的低浓度可不可以选择10

本身来说它符合这个三倍以内的要求

但是因为这个10

已经在标曲里面有这个浓度点了

所以说我们就不能选择10

我们可以选择12.5或者选择7.5

选择8都可以 但是我们不能选择10

接下来我们看一下稳定性

稳定性它主要包含了两个部分

首先是样本的稳定

样本的稳定指的就是

从我们生物样本的采集

一直到我们最后的分析进样

中间这一段时间我们能保证它的稳定性

所以首先就是全血稳定性

全血稳定性可以理解为

从血样从机体取出来之后

到它离心的这一段放置的时间

通常会考察2到4个小时

而血浆样本的稳定性指的是

你在处理这个样本之后

你可能是要从冰箱里拿出来

解冻之后放在实验台面上

不可能很快就处理完了

你可能需要一个时间

所以这叫室温放置

然后同样标本采集完之后

你也不可能立马就能检测

通常来说我们都会几个周期的样本

或者是几十个几百个样本一次性测定

这个时候就需要

它在冰箱里进行长期的冻存

至于冻存的这个温度是-80度还是-20度

取决于实际的样本储存的情况

然后还要做个冻融

冻融怎么理解

比如说我们样本来测定的时候

对于这种长期冻存的样本

测定之前肯定要让它自然解冻

这就是冻融

有的时候样本还需要复测

所以说可能还需要冻融第二次

所以说我们考察的时候

至少是要考察冻融三次以上的稳定性

还有处理液的稳定性

通常我们处理一批样品

可能一百个到二百个会放到自动进样器中

自动进样器可能进完这一百个样品

它可能需要12个小时

所以至少我们要保证在这12个小时之内

这个处理液是稳定的

所以这就叫做自动进样器的稳定性

还有一种是放在4度的冰箱

如果说你可能处理200个样品

可能自动进样器只能够放一百个样品

你还有一百个样品可能得放在冰箱里

然后等待第二天甚至是第三天来测定

所以这个时候我们就需要测定它

4度存放的时间

所以通常来说我们可能会做到96小时

这些时间点的设计都取决于在实际中

你的实验是怎么操作的

你就怎么去做这个事情

如果我可能这一周处理的样品

我想下周再分析也可以

那你这个地方96小时就不够了

你可能需要196小时

除了样本自身的稳定性之外

我们还需要考察溶液的稳定性

溶液的稳定性主要指的就是我们这些对照品

然后还有内标的这些储备溶液

以及工作溶液

它们包括在室温的状态下

在冻存的状态下的稳定性

如果你说处理液

我每次都现配 现称量现配

你就可以不做冻存稳定性

但很多实验室因为对照品相对也比较贵

也比较难以获得

所以很多时候我们肯定希望

一份对照品能够用很长时间

所以我们有的时候会把它放到负80度

这样的话

一份对照品可能它在半年内都是稳定的

所以说整个稳定性的操作

它并没有规定要做哪些内容

只要它能够涵盖实验整个流程里面

样本的稳定 溶液的稳定即可

下面介绍这个叫做基质效应

基质效应它主要针对的是质谱法检测的时候

我们才需要

如果你是用高效液相紫外法检测

你就不需要做 基质效应

它主要的定义是在样品中存在的一些干扰物质

可能会对我们药物的

响应会产生影响

这种产生影响主要是指是在这种离子化的过程中

所以说质谱很容易受到基质效应的干扰

那它的目的主要是为了防止个体的血浆

特异性的杂质对样本的检测影响

其实血浆中的杂质对我们整个药物响应

增高或者是降低其实都不重要

只要是平行的增高和降低都是可以接受的

我们担心的是有个别的 如果说整体都是下降

突然有一个个体它的血浆杂质特别特殊

它使这个浓度反倒升高了

那么这就是很大的问题

所以说我们考察的目的

主要是区分个体间的这种差别

所以说虽然我们也是做低 中 高三个浓度

和精密度是类似的

也是平行操作6份

但这个6份它是不同来源的这个基质

也就它来自于6个不同的

可以说是受试者或者是动物都可以

它主要比较对照品溶液直接进样峰面积

和空白基质和对照品溶液混在一起进样之后

进行峰面积的比较

然后主要是要求它的相对基质效应

在低 中 高三个浓度之间较接近

最主要的是要求每个浓度的RSD一定要15%以内

因为这样就保证了 如果能达到15%以内

就说明6个个体之间的差别是比较小的

现在在新版的这个验证法规中

还特别加入了叫做高血脂效应

和溶血效应

为什么加入这两个

因为首先高血脂效应

我们主要考虑的是进食之后

血浆中血脂的变化对我们药物响应的影响

怎么获得这样高血脂的血浆

对于一些CRO公司来说

它们很多时候可能是采取从国外直接购买

然后对于一些医院的实验分析室来说

我们通常来说是用脂肪乳和空白血浆

按照一定的比例进行混合

这两种目前都是可以接受的

然后溶血效应

我们主要担心是在红细胞破碎之后

它释放出来一些成分

对我们药物可能会有一些干扰

同样的溶血血浆也是通过自制的

一般是用全血进行反复的冻融

一般冻融三次之后 这样破碎了红细胞

然后我们可以和空白血浆进行一定比例混合

一般是1比50的比例进行混合

然后其它的操作以及评价的方法

都是参照基质效应

那我们现在对方法学验证进行小结

首先我们要记住

我们现在最新的法规是什么

我们现在法规是中国药典2015版

生物样本定量分析方法指导原则

所以按照这个指导原则进行操作

我们要理解每一个要做的验证项目的名称

它为什么要做

它怎么做

以及我们能够接受的标准

这一节到此结束 谢谢大家