7.5 Advances in Molecular Detection Methods在线视频

接下来我们将谈谈

基因检测方法的一些进展

我们知道在PCR中

热循环是必须的

它让PCR得以实现

热循环让两条链分离

并让引物在最佳温度时

在目标序列上重组

然而，这种方法也有缺点

因为热循环是需要时间的

如果每次循环需要2分钟

那么整个反应就需要至少60分钟

但实际上DNA链的延伸远不需要2分钟

这是时间限制

此外

热循环需要这种高耗能的专门热循环仪

而且它会消耗很多资源

进而限制了大规模测试的能力

这儿有几种可以解决这些局限性的方法

第一种叫做合并检测法（pooled test）

以减少资源约束

这个想法其实很简单

假设在整个人群中

只有少部分人中的极个别人感染了病毒

我们不用测试每一个

可以把他们合起来

测试合并后的人群

所以如果受感染的人只占很小的比例

那么大多数人群的检测结果都是阴性的

只有少数几个呈阳性

那么只有这极少数呈阳性的人群

需要进一步的测试

不断缩小范围

找到阳性案例

有数据分析显示

在感染率很低的情况下

这种检测法可以大大提高检测效率

或者节约很多资源

让我们用丹麦的真实数据来说明一下

据估计

丹麦近期每天要测试超过1万个病人

如果他们用PCR合并检测

那么每天就能比原来多测试5倍病人

或者省出25万美元

所以这真的是一个很酷又很简单高效的方法

事实上

武汉当时就是用了

合并检测法来对数百万人进行检测

而且近期北京的大规模检测

也是用了这个方法

我们也有针对热循环器

可用限制的解决方法

例如

工程师们已经找到了

热循环仪的平价替代仪器

这个仪器叫做连续流动式PCR

在这个仪器里

一套装置保持着95度

就像常规PCR的其中一个步骤一样

另一套装置则保持在60度

所以当一个样本连续地通过这些通道时

它们会经历一个从65度到95度的循环

然后再回到60度，再到95度

这样一次又一次

就像在热循环仪里一样

然而，这种方法的缺点是

每个恒温带不同位置的温度

可能不是很准确

而且使用这种非常窄的微流控管道

会造成很大的表面积和体积之比

这也意味着

在连续流动时

样本可能因为在沟槽墙

这一侧留下踪迹而更容易丢失

这导致和普通PCR相比

连续流动式PCR更有局限性

我们要讨论的下一项最新进展

叫做等温扩增技术

或者叫ITA

这项技术完全免去了循环

所以在ITA里

不需要热循环仪

而且因为没有循环

反应就可以连续进行

我们很快就能得到结果

ITA主要思路就是利用不同的

机制将两个输入dsDNAs的一条链分离

以促进引物和靶序列的退火

实现指数扩增

这里是实现这一目标的三种主要机制

一种叫做切口酶辅助扩增（NEAA）

使用切口酶进行

第二种叫做环介导等温扩增技术

简称LAMP

这种技术用茎环来调节ssDNA序列

靶点和引物退火

第三种叫重组酶聚合酶扩增技术

或RPA，它是用重组酶来实现的

接下来

我们首先介绍一下切口酶

它实际上来源于细菌的内切酶

这些切口酶的自然形式

可以识别双链DNA

一种非常特殊的纵深双链DNA序列

然后把两条链都切断

然后我们可以改造这些酶

让它失去裂解其中一条链的催化活性

完整保留裂解另一条链的活性

所以在这种情况下

它就只能切上链

没法切下链

我们称这种切口酶为上切切口酶

我们也可以通过改造或变异

让上链切割失活

只完整保留下链的切割活性

我们称这一切口酶为下切切口酶

通过使用这些切口酶

我们研发出另一种技术

叫切口酶辅助扩增技术

这种方法用到一种特殊设计的引物

这种引物不仅含有靶序列的互补序列

还包含一个供切口酶识别的限制序列

所以当这个引物沿着模板开始延伸

在延伸生成的产物中

在它的末尾

会包含一个特殊的序列

这个序列可以被切口酶识别

然后切口酶就会进入

并且只切断一条链

之后会有一个拥有链

置换活性的DNA聚合酶

大体上

当它沿着模板DNA从切口侧延伸时

会分离之前退火的DNA链

然后被分开的DNA链会成为模板

开启新一轮的引物退火

切口以及延伸

这样就形成了扩增循环

像PCR一样

这个过程会一直延续

连续不断地进行指数扩增

除了这边的这些

这个新合成的DNA可以被再次刻划

进行连置换延伸

所以这个小循环也会继续进行

形成另一层扩增

因此在这个方法中

扩增是连续不断的

而且速度非常非常快

据了解

雅培（Abbott）ID NOW

称对新冠病毒阳性样本检测只需5分钟

对阴性样本检测需13分钟

它可能用到了这种扩增技术

但是这种猜想并没有被证实

第二种恒温扩增技术叫做

环介导等温扩增技术，简称LAMP

这种技术利用了DNA环

这个图示中

一条线代表一条单链DNA分子

基本上在这里我们有很多不同的引物

第一个引物在这里

它包含了B1序列的互补序列

B1序列也在靶序列之中

随着退火延伸的进行

就会出现第二个引物

叫做B3引物

它会在这附近延伸

通过链置换活性

它会将B2链会与目标DNA分离

后B2链会作为第三引物的模板

第三引物会包含目标DNA上

F1c序列的互补序列

它会延伸形成双链DNA

然后第四引物F3会在

第三引物的外侧与目标结合

然后连置换活性

会把这条链和目标链分离

通过这两步

我们会得到一个这样的DNA

其中一边的环连接F1序列

和它的互补序列F1c

另一边也形成有一个环

连接着B1c序列和它的互补序列B1

这个环很重要

因为延伸之后

在这个例子里

延伸之后F1序列延伸并展平B2环

但是F1的环还是闭环

F1就还是一个很强的单链DNA

并且因为它是单链的DNA

就允许引物和序列结合

然后这个引物会被延伸

通过链置换活性

它会和之前重组的序列分离

例如这个

一旦序列分离

它会成为一条DNA单链

另一边

B1和B1c会再次形成一个环

就会导致含有B2序列的

单链DNA被再次填装

就这样，引物结合会继续进行

形成指数扩增

并且这个过程也是连续的

所以反应的速度很快

因为强置换聚合酶有温度要求

所以这个反应通常在65度条件下进行

ITA的第三种形式是利用重组酶

首先先将重组酶与引物预先培养形成复合体

然后在目标DNA序列出现时

重组酶会先把靶DNA分离成单链DNA

然后驱动引物和目标序列的重组

一旦引物重组成互补链

链置换就会开始

并形成一条新的链

分离另一条链

在这个反应中

为了更加高效

引导物中包含了一种叫做

单链DNA结合蛋白质的蛋白质，简称SSB

这种蛋白质会和被分离的单链DNA结合

并稳定它

这和PCR很像

每次循环，也不能叫做循环

因为它是连续进行的

重组酶会进入将双链分离

然后驱动引物重组

形成一条新链

这种思路也很快

以上提到的等温扩增方法

也可以用嵌套的方式组合使用

比如，第一次反应里

稍大一些的区域可以被扩增

然后扩增出来的DNA序列

可以作为输入序列进行第二轮扩增

与第一次相比

这次会放大序列的更里面的部分

这使得等温放大可以实现更大的放大

等温扩增的问题

就像PCR中会形成引物二聚体一样

等温扩增中也会形成非特异性扩增

事实上，等温扩增中的情况更糟

因为这种非特异性扩增一旦形成

它会被不断地放大扩增

而且它们会严重影响其他的扩增

例如目标序列的扩增

而且因为他们通常很小

它们扩增的也会更快

数据表明输入较低

输入较低时

恒温扩增是非特异性的

有办法让性恒温扩增具有特异性吗

有的 这堂课最后一部分

我们会讲到几种提高特异性的方法

第一种方法是使用特定的

DNA探针检测扩增产物

不再染色检测

因为染色基本会检测到所有产物

这种DNA探针叫TaqMan探针

用途广泛

是一小段DNA 就像先导物一样

具有目标产物的互补基因序列

探针的两端是设计好的

染色基团和荧光淬灭基团

因为DNA探针很短染色基团

和荧光淬灭基团相距很近

染色基团的荧光就会被淬灭

所以看不到荧光

若检测大目标序列

探针会与其形成双螺旋退火

当聚合酶继续延伸时会遇到退火探针

聚合酶具有核酸酶活性

分解DNA探针表达出染色分子

就能观察到荧光

目标序列越多

染色分子表达越多 荧光信号就越强

这一方法的基础是DNA退火

这一方法很有针对性

也能容忍一些误差

另一种方法是用酶识别特定的序列

众所周知的就是CRISPR系统

有时也成为CRISPR-Cas9系统

这一系统是通过细菌检测并清除病毒的

这一检测系统含三部分

Cas9酶 一种蛋白质

反式激活crRNA和向导gRNA

引导RNA的序列和目标序列互补

Cas9 crRNA和gRNA结合成活性复合物

当这组复合物和目标产物结合

Cas9识别到gRNA和目标序列结合后

Cas9被激活 对目标序列进行切割

能够切割病毒

这样的系统具有极高的针对性

我们会利用这一优势

继续提高恒温扩增的特异性

过去几年

新型CRISPR系统也逐渐涌出

CRISPR-Cas9属于第二类系统

在第二类系统中研究人员也发现了其他的酶

值得关注的是第六类系统

这类酶具有RNA核酸结构域

其中C2c2 Cas13

是由麻省理工学院的张锋团队发现的

他们发现这种酶能与crRNA形成复合物

就像Cas9和向导RNA形成复合物一样

这一crRNA具有目标产物的互补序列

crRNA和目标产物结合后

Cas13收到信号

Cas13酶得到激活切割单链RNA

Cas13系统的特点在于

Cas13能够将RNA核酸结构域暴露在外面

这样我们就能随意切割附近的RNA了

这样很高效

我们称之为附带切割效应

这有助于防止细菌受到病毒感染

因为mRNA会表达出大量的蛋白质

细菌需要消灭其中大部分的蛋白质

才能不受感染

不过当Cas13被激活时

这些Cas13可以清理掉

附近大量的病毒mRNA

这种效应正在用于开发高特异性

核酸检测技术 SHERLOCK

意为特异性高灵敏度酶促解锁技术

Cas13复合物加入到目标RNA或DNA序列中

然后再加入特定的单链报告RNA进行反应

报告RNA和TaqMan类似

一端有染色基团

另一端有荧光淬灭基团

只有目标序列存在时

Cas13复合物才会被激活

Cas13才会清除掉附近的RNA

包括报告RNA

并切割释放荧光基团

这时我们可以观察到荧光

目标序列增殖越多

Cas13切割报告RNA的速度越快

荧光越明显

所以Cas13检测可与恒温扩增相结合

比如之前提到的RPA或RP

与逆转录共同实现RNA检测的方法

RPA产物转录为RNA 与Cas13检测相结合

这种方法灵敏度强特异性高

最初的实验发现

这两种方法结合能检测到aM浓度级别

此外这种方法的特异性很高

即使少数crRNA和目标序列

配对出现错配问题

检测结果也会有很大不同

加利福尼亚大学的杜德纳实验室

在Cas12发现了与相似的附带活性

能够切割单链DNA

他们将这种技术称作DETECTR

还有一些其他的酶能够实现这种附带效应

所以结合探针和CRISPR系统

恒温增增殖检测的特异性得到了显著提升

有的学者在新冠疫情爆发之初

就提出用恒温增殖技术检测新冠病毒

因为这种技术检测时间很短

比传统的qPCR时间短的多

也不需要昂贵的qPCR设备

甚至有些技术已经得到

美国食药监局认证准备进入临床实验了

以上就是我们这节课的全部内容

望各位身体健康 暑假愉快