当前课程知识点：医学实验技术与方法新进展 > 第三章 免疫组化 > 第1节 免疫组化 > 免疫组化
同学们 大家好
今天我们学习的内容是免疫组化
我将从三个方面来介绍该部分内容
第一是免疫组化的定义 分类 用途
第二是免疫组化的原理 染色步骤
第三是免疫组化结果的判定
首先我们来介绍免疫组化的定义
免疫组化是应用免疫学基本原理
即抗原 抗体特异性结合的原理
通过化学反应的方式使标记抗体显色
来达到对目标蛋白进行
定位 定性和相对定量的一种方法
通常情况下我们根据标记物的种类不同
把免疫组化分为免疫荧光法
免疫酶法 免疫金法和放射免疫自显影法等
其中免疫酶法包括DAB法
免疫组化的用途主要是用来
对组织细胞内蛋白和独特的定位和相对定量
在介绍这些基本的情况以后
我们来介绍免疫组化的染色步骤和原理
首先我们以DAB染色方法进行简单的介绍
就是我们得到的组织切片
蓝色部分显示的就是非目标的检测蛋白
而红色部分就是显示的我们要检测的目标蛋白
这个组织切片经过漂洗以后
我们在组织切片上面加入封闭蛋白
这封闭蛋白就会与
目标蛋白和非目标蛋白进行非特异性的结合
这种结合的特点就是结合率低 容易分离
通常情况下封闭蛋白是在10往下封闭1小时
封闭完了以后我们就会在
组织切片上面加入
针对目标蛋白的特异性地1抗
在这个时候目标蛋白和1抗之间的关系就是
抗原和抗体之间的关系
由于抗原抗体之间的结合是一种特异性的结合
所以它们这种结合是特别牢固的
当这个1抗它孵育过程中
1抗就会把
目标蛋白上面的非特异性的封闭蛋白挤走
自己取而代之
而在这个非目标蛋白的区域就是蓝色的区域
1抗和封闭蛋白都是一种非特异性的蛋白
所以它无法把这个封闭蛋白
从这个非目标蛋白上挤走
所以1抗孵育的结果就会出现这种情况
目标蛋白上面结合的就是特异性的抗体1抗
而在非目标蛋白区域结合的就是封闭蛋白
1抗孵育完毕后切片进行漂洗
我们加入针对1抗的特异性2抗
这个时候1抗和2抗之间的关系就是
抗原和抗体之间的关系
2抗通常情况下是在室温孵育两小时
孵育完毕以后
我们加入预先准备的ABC复合物
对ABC复合物的孵育的过程
就会有2抗特异性的结合
通常情况下
ABC复合物在这个室温是孵育1小时
孵育完毕以后经过漂洗我们加入DAB显色液
我们就得到这样的结果
这是一个胞浆蛋白显色的结果
我们显色的是黄色的
而这是一个胞核蛋白显色的结果
显色也是黄色的
接下来如果是您要做这个免疫荧光的染色方法
它的步骤是与这个DAB染色的方法是基本类似的
同样的组织切片也会
经过漂洗以后加入这个封闭蛋白
同样的也会加入
针对这个目标蛋白的这个特异性的抗体
1抗孵育完毕以后
我们也会经过漂洗以后加入
针对1抗的特异性的2抗
在这里要强调一下的是
这个2抗看和DAB的2抗是不同的
这个2抗上面带有荧光所以
就可以直接检测观察这个结果了
这就是我们得到的免疫荧光染色的结果
这是一个红色的荧光素
显示的是胞浆蛋白的显色结构
这绿色荧光是这个胞核蛋白显色的结果
这是这张和这张图片重叠以后得到的结果
在讲完这个染色的步骤和原理以后
我们来讲介绍这个结果如何判定
首先我们介绍的是判定的方法
在判定方法可以从四个方面来考虑
首先是开始判定结果之前
首先我们在理论上面明确目标蛋白的表达部位
第二就是在染色的时候
最好是要做一个不加1抗的空白对照
判定结果的时候
我们也比较阳性结果和空白对照之间的差异
来确定这个染色的特异性
第三是看结果的时候最好是先看正常对照
再看实验组
第四就是在看切片的时候
切片内部我们要找一个内部参照的部位
就是理论上不表达的部位
来确定这个染色的特异性
下面我们来运用这些方法
拿实例判断这个免疫组化的结果
这是一个GM130染色的结果
它显示的是
GM130标记的是细胞内质网
大家都知道内质网是位于胞浆里面的
这就是它显示的这个结果的一个细胞
这是另外一个细胞
在这个细胞里面
这个黄色的就是它们抗体染色的阳性产物
而这个就是细胞核所在的区域
我们显示的是淡蓝色的
看这个细胞里面
在核的周边包裹了黄色说明黄色的产物
是位于这个胞浆里面
同样的我们在同一张切片上面
内部的操作部位
这就是细胞外面我们没有发现明显的阳性产物
这是空白对照
我们也没有发现明显的黄色的阳性产物
所以从这个三方面考虑的时候
这个抗体的染色是特异的
也许有同学说
老师您看这个
细胞瘤区域里面也有黄色的产物
这是不是非特异的 不是的
这是特异的
这是由于我们照相的时候
由于我们从上往下照相的时候
部分的胞浆的影像就会投影在这个胞核的区域
所以去掉这种影像
通过这个例子大家也许会觉得
免疫组化结果的判定是很容易的
那我们再看一下这张图片
这次需要替换抗体的染色
是一个谷氨酸转运体1的抗体
它主要是表达的星形胶质细胞里面
我们看这个结构染色是特异的吗
我告诉大家这个结构染色是特异的
理由是什么
大家都知道星形胶质细胞是广泛表达的
而这个叫GLT1标记的星形胶质细胞
所以在这个组织切片的时候
整个切片是一片黄
接下来我们判断就是找这个内部的参照物
这个是一个血管
这个是细胞核的部位
我们看这两个内部长度
正常情况下是不表达黄色的
我们看这个切片上确确实实也不表达
所以从这个理论表达部位和理论不表达部位
我们可以判断这个染色是特异的
接下来我们看这两张图片以后
你就会明白这个结果是特异的
这是正常的海马GLT1染色
这是部分星形胶质细胞丢失以后的这个
星形海马GLT1的染色我们发现
这个星形胶质细胞丢失以后
这个海马的GLT1的染色出现了斑片状的丢失
所以进一步的证实了这个GLT1的特异性
接下来我们看看这个抗体染色
这是给我印象最深刻的一个抗体的染色
这是LCN2
正常的时候在这个大脑里面是不表达的
但是在这个病理调节下
当星形胶质细胞活化以后
它可以表达这个LCN2
所以我们这个红色荧光标记这个LCN2
把星形胶质
深绿色的标记等于GFAP染色标记的
这两张切片重叠以后得到这个图
我们发现只要有绿的地方就有红的
说明LCN2蛋白主要是表达的星形胶质细胞
而在这没有绿的地方就是细胞外面
星形胶质细胞外面是不表达红的
说明它不在非星形胶质细胞表达
所以从这个两个图片上说
你没办法认为它不特异
但是如果说我们仔细推敲这个病理情况下的时候
我们就会发现
在病理条件下面同一部位
星形胶质细胞活化程度是参差不齐的
而这个理论上这个LCN2细胞被活化的越厉害
他表达的这个量就越多
但是我们的染色的时候发现它表达很均匀
这与我们平时我们想象的的病理条件是不一致的
所以我们就怀疑这个结果的染色的特异性
所以我们进一步买了另外一个公司的抗体以后
同样的我们把这个LCN2染成红色的
我把这个星形胶质细胞染成绿色的
这是它们两者重叠的结果
我们看这个细胞的胞体
这个星形胶质的胞体变大了
这说明这星形胶质不活化了
它对应的这个部位它红色的是高表达的
所以重叠以后得出的是橘黄色的
说明它是高表达的这个LCN2
但是你们看这个星形胶质细胞它胞体是小的
这说明这种星形胶质细胞是非活化状态
是静息状态
而理论上这个星形胶质细胞是不表达二三度的
所以我们在这重叠以后没有看见明显的黄色
所以说明没有染色的
所以这个抗体染色结果就与我们
理论上得到的结果不一致
它表达了星形胶质细胞
但是它只表达了活化的星形胶质细胞
而不表达静息状态的星形胶质细胞
所以综合这两段切片的染色情况
我们得到这个染色的结构它是特异的
所以从这个正常的切片我们也同时发现
在判断结果的时候
预先明确这个目标蛋白的理论表达部位
对判断结果的特异性具有很重要的意义
今天的课就到这 谢谢大家
-第1节 医学实验中心基本情况
-第2节 研究人员进室流程和管理制度
-第3节 实验实施
--实验实施
-第4节 实验总结
-- 实验总结
-第一章 课件
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-第1节 流式细胞仪的工作原理
-第2节 流式细胞仪的数据显示及分析
-第3节 流式细胞仪的应用
--流式细胞仪的应用
-第二章 课件
--第二章 课件
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-第1节 免疫组化
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-第三章 课件
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-第1节 细胞培养的基本概念
-第2节 细胞培养的基本条件
-第3节 细胞培养的基本方法
-第4节 干细胞治疗
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-第2节 体内药物分析技术——分析方法学验证
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-第七章 课件
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-第1节 NCBI相关资源
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-第2节 基因及变异命名规范
-第3节 基因变异致病性预测相关分析
-第4节 蛋白质序列及结构分析
-第八章 课件
--第八章 课件
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