2.1.1蛋白质表达策略（上）在线视频

大家好

我是来自中国科学院

北京生命科学研究院的宋豪

今天我给大家介绍一下

蛋白表达的策略

上一节通过中心法则的学习

我们都知道

DNA先转录成mRNA

经过剪接等加工后

翻译成蛋白质

而正确折叠

及加工的蛋白质是

生命活动的直接执行者

根据来源不同

蛋白质可以分为两大类

一类是天然蛋白质

一类是重组表达的蛋白质

在分子生物学时代到来之前

人们想获得某一蛋白

就需要从特定组织

或细胞中分离提取

比如

上世纪五十年代

John Kendrew用X射线

晶体衍射技术解析了

晶体衍射技术解析了

抹香鲸肌红蛋白的三维结构

这是世界上

第一个获得结构解析的蛋白质

Kendrew也因此

获得了1962年的诺贝尔化学奖

肌红蛋白

之所以被率先纯化并解析出结构

得益于肌红蛋白在

肌肉组织中表达丰富

相对容易获得

而有些蛋白质

却只在特定时间

或特定组织中有微弱表达

这种情况下

就很难获得大量原材料

另外

由于天然蛋白质没有纯化标签

很难与细胞内其他蛋白区分

这给后续分离纯化步骤

带来很大的麻烦

随着基因工程技术的发展

重组蛋白的表达得以实现

基因工程是利用DNA重组技术

在体外通过人工剪切

和拼接等方法

对各种生物的基因进行

改造和重新组合

然后导入微生物

或真核细胞内

使重组基因在细胞内表达

产生出人类需要的基因产物

这就使得人的基因

可以转移到大肠杆菌中表达

细菌的基因也可以转移到

其他物种中表达

表达出来的蛋白

我们称之为重组蛋白

事实上

重组蛋白的表达意义非常重大

以药物领域为例

1982年

世界上第一个重组蛋白类药物

重组人胰岛素上市

开启了重组蛋白药物发展的

光辉历史

随后又有重组人生长激素

以及各种重组人细胞因子类等

重要药物相继上市

这些重组蛋白药物的研发上市

推动了生物药的高速发展

从二十世纪九十年代后期

到二十一世纪初

重组蛋白类药物的研发风向

向单克隆抗体药物转变

一批重磅药物如曲妥珠单抗

阿达木单抗

PD-1/L1单抗相继上市

开启了重组蛋白类药物新的征程

而在科研领域

如何能成功表达

纯化到你感兴趣的蛋白

进而研究其结构与功能

开发疫苗和药物

是大家经常要面临的问题

因此

下面我将介绍一下

蛋白表达的基本策略

在重组蛋白表达设计前

您需要做一些准备工作

首先

您要对要表达的蛋白

有个初步认识

了解蛋白的功能

比如它是原核

还是真核细胞表达的

属于什么蛋白家族

表达在什么组织

器官或细胞

与哪些蛋白存在相互作用

发挥什么生物学功能等等

第二

你要了解蛋白的结构

比如

其三维结构是否已经解析

或是否存在

其同源相似蛋白的三维结构

分析其二级结构组成

等等

第三

你要了解

蛋白理化性质

分析序列获得其分子量

等电点

信号肽

跨膜区

疏水性

翻译后修饰等特征

了解了这些

您才能有的放矢的去借鉴

前辈们积累的一些成功的

蛋白表达策略

进而设计出

适合自己研究的表达策略

重组蛋白表达的基本流程

是这样的

首先

需要选择合适的表达系统

即采用什么菌株

或细胞来表达你的目的蛋白

其次

你要选择配套的表达载体

并将目的基因插入到表达载体上

这其中涉及到构建的截取

纯化标签的选择等等

然后

将构建好的载体转化

或转染到细胞里

进行表达条件的摸索

随后进行蛋白的纯化

并通过一系列手段

鉴定蛋白并检测活性

获得蛋白后

即可进一步

进行结构生物学研究

或功能研究

其中如果在

后续步骤发现问题

都可能需要

对表达系统或载体构建

进行优化

表达系统目前可分为三大类

和新兴的

分别是原核表达系统

真核细胞表达系统

和新兴的无细胞表达系统

其中原核表达系统

以大肠杆菌表达系统最为常用

真核细胞表达系统中

昆虫细胞表达系统

和哺乳动物细胞表达系统

最为常用

每种系统

均有其各自的优势

和局限性

比如

大肠杆菌表达系统具有

周期短

培养条件简单

表达量大

成本低等特点

但它表达的蛋白没有翻译后修饰

这导致其有些时候难以表达一些

哺乳动物蛋白

而昆虫细胞表达系统

带有近似于哺乳动物细胞的翻译后修饰

因此

与原核

酵母或其他真核系统表达相比

可以生产与天然哺乳动物蛋白的抗原性

免疫原性和功能相似的重组蛋白

昆虫细胞表达系统的另一个特点

是可实现2个

甚至多个蛋白的共表达

此外其细胞生长条件简单

可方便地转换为

高密度悬浮培养

从而用于大规模的蛋白表达

但前期准备的周期较长

哺乳动物细胞表达系统

适用于表达具有最天然结构

和活性的哺乳动物蛋白

可以实现

最高水平的翻译后加工

使蛋白

获得最佳功能活性

适合在最类似生理学环境下

研究特定蛋白质的功能

它常用于抗体

和治疗性蛋白质等的生产

可瞬时或稳定表达

但其培养条件严苛

成本高

而无细胞表达系统是使用全细胞的

可翻译提取物

进行蛋白质的体外合成

即利用人类细胞

CHO及中国仓鼠卵巢细胞

或细菌的裂解物快速合成重组蛋白

一般而言

全细胞

提取物中包含翻译

和翻译后修饰所需的

全部大分子组分

这些组分包括调节蛋白因子

转录因子

核糖体

tRNA和氨基酸

再体外加入RNA聚合酶

辅助因子

核糖核苷酸

和特定的基因模板后

这些提取物可在几个小时内

合成目的基因

因此

无细胞表达

无需细胞培养

即可实现重组蛋白的快速合成

此外

能添加非天然组分

比如

用修饰的氨基酸

实现蛋白质标记以及蛋白表达

但是使用成本较高

再跟大家介绍一下表达载体

表达载体就是将目的基因

构建到一个能在宿主细胞中

大量繁殖的DNA分子

如质粒等载体上

并增加表达元件 如启动子

核糖体结合位点

终止子等

使目的基因能够表达的载体

典型的表达载体

一般包括至少四个主要元件

一是

包括启动子

和基因终止子在内的

编码目的基因的序列

二是细菌的复制起始点

三是

特定宿主的抗生素筛选基因

比如潮霉素 B

嘌呤霉素等选择性抗生素抗性

四是大肠杆菌的抗性基因

如氨苄青霉素

卡那霉素等选择性抗生素抗性

这其中

合适的启动子尤为关键

不同的表达系统

选择的启动子是不一样的

如对于原核细胞表达系统

常用的是乳糖操纵子

利用IPTG

也就是异丙基硫代-β-D-半乳糖苷

来诱导启动目的基因的表达

对于昆虫细胞表达系统

常用的是PH及P10启动子

而对于哺乳动物细胞表达系统

常用的有CMV

SV40等启动子

对于无细胞表达系统

含T7启动子

目的基因在内的DNA片段

及RNA聚合酶需要同时使用

以转录成mRNA

并进一步翻译成蛋白

以大肠杆菌表达系统来说

已经有很多商业化

表达载体可供选择

比较常用的有PET系列的

如Pet21a等

以及带有GST

也就是谷胱甘肽S

转移酶助溶标签的

pGEX系列

如pGEX-6P-1等等

大肠杆菌表达的基本流程如图所示

载体构建好以后

转化宿主细胞

筛选阳性克隆

然后挑取阳性克隆进行培养

在合适条件下

添加IPTG等

诱导剂进行诱导表达

同时控制

细胞表达时的温度

诱导剂浓度

诱导时间等

然后收取样品进行蛋白质鉴定

可根据SDS-PAGE

等结果来进一步优化表达条件

待成功后

即可进入大量表达与纯化阶段

这其中

除了有很多载体可供选择

大肠杆菌的表达菌株也有不同

如最常用的

是BL21（DE3）菌株

而如果表达毒性蛋白

可以选用pLys系列

如果表达真核细胞的蛋白

也可以尝试Rosetta

需要指出的是

对于有些蛋白

尽管有很多载体

表达菌株

以及诱导条件可供选择和优化

但有时

你可能依然不能有效的表达出

有活性的目的蛋白

一方面

可能是蛋白根本就没有表达

这种情况可能是

原核表达系统的局限

另一方面

有可能蛋白虽然表达

但形成了一种不溶的沉淀形式

如果是第二种情况

其实是有希望进一步尝试获得目的蛋白的

这种无活性的

不溶性聚集物

我们称之为

inclusion body

包涵体

它可能是由于蛋白表达量过高

没有足够时间正确折叠

缺乏修饰等原因导致的

不过

形成包涵体后的目的蛋白

往往表达量很高

而且更容易通过离心等手段纯化

如果能在体外

将包涵体变性

再复性成具有正确构象的可溶形式

就可以成功获得

有活性的目的蛋白

方法就是将细菌悬液超声或高压破碎

高速离心后

包涵体为沉淀形式

只要用含有

6M盐酸胍或

8M尿素的溶解液

即可将包涵体溶解

这时包涵体处于变性状态

随后

将溶解的包涵体滴入不含变性溶剂

而含有复性溶剂如精氨酸

及一定比例的还原性和氧化性

谷胱甘肽

GSH和GSSG等的复性溶液中

一部分蛋白即可以

自动折叠

成具有活性的正确构象

这就是蛋白的体外复性过程

随后

可以通过

浓缩及纯化

来进一步鉴定蛋白的活性

当然

复性的方法不止这一种

也不是所有蛋白都能成功复性

但是

也不要小看复性这种方法

我之前提到的人类首个上市

重组蛋白类药物

重组人胰岛素

以及重组人干扰素等

就是通过复性的方法获得的