当前课程知识点:蛋白质表达纯化与功能研究 > 纯化策略及扩展应用 > 3.7 膜蛋白 > 3.7.1
大家好
我是来自于上海科技大学的廖军
我今天给大家讲解
膜蛋白的纯化这个章节
希望我的讲解能够帮助
大家加速膜蛋白的
基础和转化研究
基因组测序表明
在多数物种中
20%到30%的
基因编码膜蛋白
FDA批准的药物
有60%以上靶标膜蛋白
尽管膜蛋白具有
重要研究价值
但很多相关研究
受限于表达量
和纯化困难而进展缓慢
膜蛋白具有跨膜区疏水
膜外区亲水的特点
用双亲性的去垢剂
萃取膜蛋白
是现在常用的膜蛋白纯化方法
特定脂类
是某些膜蛋白保持活性的关键
近年来
去垢剂和脂类化学的发展
大大地推动了膜蛋白的研究
本次课程分为四个章节
第一个章节是讲述生物膜的特性
让大家理解生物膜
脂双层的特点和膜蛋白的分类
第二个章节
讲述去垢剂的特点
和在膜蛋白纯化中的作用
第三章讲述
膜蛋白过量表达和
纯化的注意事项
在最后一章
我们将通过几个具体的
膜蛋白纯化实例加深大家的理解
膜蛋白的来源既可以是原核生物
也可以是真核生物
原核生物通常只有单层的细胞质膜
真核生物除具有细胞质膜外
在各种细胞器上也具有膜结构
由于细胞器膜
与质膜
所面对的环境和发挥的功能不同
这些脂双层的理化性质也不同
这些都是在膜蛋白表达
和纯化时必须考虑的环境变量
生物膜通常
是脂双层结构
厚约3nm
每个脂分子
可以分为亲水的
极性头部和疏水的碳链尾巴
头部和尾巴的化学性质
包括基团种类
长度
以及化学键类型等变化多样
脂分子的这种多样性
决定了生物膜的多样性
组成生物膜的脂主要有磷脂
糖脂和固醇三大类
其中
磷脂通常含有两个疏水的
脂肪酸“尾巴”
和一个亲水的
磷酸基团头部
头部和尾巴通过甘油分子连在一起
磷酸基团头部
可以进一步被有机分子
例如
胆碱 乙醇胺
和丝氨酸等修饰
磷脂是形成
生物膜脂双层的主要成分
在糖脂中
磷酸基团被糖分子取代
后者通过糖苷键与脂分子其他部分相连
糖脂的主要功能是维持了
细胞膜的稳定和参与细胞间识别
譬如免疫反应
和组织形成等
固醇是甾体分子的一个子类
甾体的核心是由17个碳原子
形成的融合四元环结构
甾体主要有两个生物学功能
第一个是调节细胞膜的流动性
第二个是
作为信号分子
大家最熟悉的固醇分子是胆固醇
它是许多
维生素和甾体类荷尔蒙的前体
膜蛋白可以分为外周膜蛋白
和嵌膜蛋白两大类
外周膜蛋白是位于细胞膜外
能够与细胞膜脂双层短暂和可逆地结合的蛋白
这些蛋白通常被
当做水溶性蛋白纯化
嵌膜蛋白是永久地
附着于生物膜的蛋白
也是我们通常称呼的膜蛋白
这些蛋白
在三维结构上分为疏水区域
和亲水区域
根据嵌入脂双层的方式
我们可以将嵌膜蛋白
分为四种类型
类型I
通过C端
共价键连接到嵌膜的短链糖脂上
类型II和III都是单次跨膜蛋白
前者是C端朝内
后者是N端朝内
类型IV是多次跨膜蛋白
类型IV膜蛋白的表达和纯化
难度最大
也是我们本次课程讲解的重点
我们如果想让膜蛋白
在水溶液环境中稳定地悬浮
需要使用去垢剂
去垢剂分子像脂分子那样
具有极性头部和疏水尾巴
因此
去垢剂可以通过与脂分子
竞争与膜蛋白的结合
将膜蛋白从生物膜
脂双层中萃取出来
在水溶液环境中
多个去垢剂分子
它的疏水尾巴可以覆盖
膜蛋白的疏水区
极性头部与水分子作用
从而形成稳定的膜蛋白
脂 去垢剂复合物
去垢剂依据荷电状况和化学组成
分为四个类型
第一类是离子型
顾名思义
这类去垢剂通常荷电
例如带有荷负电的磺酸基团
或荷正电的季铵基团
第二类是胆酸盐类
细心的学员可以发现
这类去垢剂也是甾体衍生物
第三类是非离子型去垢剂
这类去垢剂不含有荷电基团
第四类是两性离子型去垢剂
这类去垢剂分子内带有
同等量的正负电荷
所以整体电荷为零
在膜蛋白的结构与功能研究中
通常使用非离子型
和两性离子型去垢剂
萃取和纯化膜蛋白
这里我要强调一个重要的概念
临界胶束浓度
英文缩写是CMC
临界胶束浓度是指
特定的去垢剂浓度高于某个数值时
该去垢剂会形成胶束
换句话说
后续加入的去垢剂不会增加
体系中的游离去垢剂数量
而是参与到胶束形成
在我们后续的讲解中
将反复提及CMC
统计表明
膜蛋白纯化中最常用的去垢剂
主要有麦芽糖苷衍生物DDM和DM
葡萄糖苷衍射物
OG/NG等
这些去垢剂占
发表的膜蛋白结构
研究文章的70%
膜蛋白纯化
和功能研究的简要流程如下
首先
从异源表达体系或者天然粗提物中
富集含有目标膜蛋白的生物膜组分
然后用去垢剂萃取膜蛋白
接着运用层析手段提高
目标蛋白的纯度
纯化后的目标蛋白
继续进行功能和性质的研究
在纯化过程和功能研究中
需要根据实验目标
优化去垢剂的种类和配比
相对于天然提取物
异源表达的膜蛋白
具有成分均一
重复性好的优点
因此
异源表达日益成为
获得膜蛋白的主要手段
但是
膜蛋白的异源表达存在诸多困难
首先
作为细胞的门户
膜蛋白的表达
通常会使细胞处于不健康的状态
这反过来限制了膜蛋白的表达量
其次
具有活性功能的膜蛋白
必须插入到膜里
而膜体积有限
因此
多数膜蛋白的表达量
比水溶性蛋白低一个数量级
由于膜蛋白表达量低
通常平行尝试不同的表达体系
或者
尝试来源于不同物种的同源蛋白
来增加目标蛋白表达成功率
现有的异源表达系统
分为原核与真核系统
这里已经列表
不再详述
但是
需要特别指出的是
原核表达体系通常不适合
真核膜蛋白表达
这主要有以下原因
一
真核生物的膜系统的脂类
与原核体系
的差异较大
二
真核细胞的细胞器
通常参与膜蛋白的折叠与翻译后修饰
而原核体系通常缺乏细胞器
选择合适的去垢剂
对于膜蛋白的成功纯化很关键
这里列出了
选择去垢剂的一些规则
第一
一个合适的去垢剂
通常能够在细胞膜组分中
萃取出最大产量
具有生物学活性的目标蛋白
第二
一般用大大高于CMC的
去垢剂浓度萃取膜蛋白
但保持去垢剂
与膜蛋白的浓度比最低
第三
首先尝试那些与
目标蛋白生化性质
和功能研究相似的
研究中已经使用过的去垢剂
第四
有些膜蛋白
在非常窄的
去垢剂浓度中保持活性
当去垢剂浓度低时
蛋白不溶解
当去垢剂浓度高时
蛋白变性
第五
如果一个膜蛋白
在特定的去垢剂中没有活性
但是添加一些脂类后
膜蛋白恢复活性
则这个去垢剂仍然是有效的
我们接下来用三组图例展示去垢剂种类
PH值和盐浓度以及脂分子种类
对于膜蛋白纯化效率和功能活性的影响
这里的图1展示的是
某原核膜蛋白
被不同去垢剂萃取的效率比较
以及该膜蛋白在这些去垢剂中的稳定性比较
从此图我们可以看出
麦芽糖苷类去垢剂
例如UDM和Cymal-6
可以很好地萃取该膜蛋白
并维持该蛋白的结构稳定性
而LDAO foscholine等
则不适合该蛋白的萃取和稳定
图2显示的是某跨膜蛋白
在不同pH值和NaCl浓度下
凝胶过滤层析结果比较
首先 我们可以看到
高的NaCl浓度可以提高该蛋白的回收率
其次 该蛋白在pH5.2的条件下
洗脱峰的对称性最好
表明偏酸的pH值
有助于维持该蛋白构象均一性
图3显示的是不同脂类分子
对膜蛋白稳定性的影响
这里的研究对象是
结核分枝杆菌的大传导率
机械敏感通道蛋白MscL
左图显示
磷脂酰肌醇磷酸比其他脂类
能够更好地稳定MscL
右图显示
MscL随着结合的脂量增加而变得更稳定
上述的三个图例提示我们
纯化膜蛋白时
去垢剂和脂类的种类和数量
以及pH值和盐浓度
都是必须优化的参数
与水溶性蛋白纯化类似
一个高效的膜蛋白层析方案
通常包括亲和层析
离子交换层析和凝胶过滤层析
在亲和层析时
联合使用两个以上的亲和标签
通常就可以
获得纯度达90%以上的
目标蛋白
由于膜蛋白的N端
氨基酸残基序列
影响膜蛋白整合入膜的效率
我们通常采用
亲和标签放在膜蛋白C端的方法
在用凝胶过滤层析纯化膜蛋白时
由于膜蛋白是以蛋白
脂 去垢剂复合物形式存在
膜蛋白的表观分子量
通常大于理论分子量
离子交换层析通常是可选项
当目标蛋白与杂蛋白
在分子量上接近
而电荷分布不一致时
可以采取离子交换层析
-总论
-总论
-第一章
-第一章
-2.1 蛋白质表达策略
-2.2 蛋白质电泳与免疫印迹
-第二章测试
-3.1 凝胶过滤层析
-3.2 亲和层析
--3.2 亲和层析
-3.3 离子交换层析
-3.4 ÄKTA实验操作
--3.4
-3.5 疏水层析
--3.5
-3.6 多模式层析技术
--3.6
-3.7 膜蛋白
--3.7.1
--3.7.2
-3.8 病毒
--3.8 病毒
-3.9 水溶性蛋白
-第三章测试
-4.1蛋白相互作用技术及应用
--4.1.1
--4.1.2
-4.2 Biacore实验设计和操作
--4.2.1
--4.2.2
--第四章测试
-结束
-结束