3.2 亲和层析在线视频

大家好

我是来自于上海科技大学的刘恒

很高兴给大家讲解

亲和层析技术这个章节

我讲解的内容

包含以下几个方面

一 亲和层析的基本理论

二 亲和层析的实验操作和注意事项

三 亲和层析在分离纯化生物大分子中的应用

下面我首先介绍亲和层析的基本理论

亲和层析

是一种通过生物分子之间的

特异性的识别并相互作用

来分离纯化物质的一种层析方法

如酶与底物

抗原与抗体之间的

专一的相互作用等

将其中一种分子作为配体

固定在填料上

就可以从初始样品中

吸附相应的生物分子

通过洗脱将其解离

达到纯化的目的

亲和层析的相互作用

可以是静电作用

氢键

疏水相互作用

配位键

和弱共价键等综合作用的结果

亲和作用体系的特异性

可以分为高特异性和群特异性

高特异性是指配体

与目标分子之间的相互作用呈现一对一关系

例如

抗原与抗体的结合

酶与底物结合等

群特异性是指配体

能和一类分子进行结合

如免疫球蛋白与A蛋白

或G蛋白的结合

酶与多种配体金属离子的结合等

在亲和层析中

影响亲和作用的因素

主要有以下几种

一 离子强度

亲和作用的强度随着离子强度升高而降低

二 PH

过酸或过碱的条件下通常削弱亲和作用

三 抑制氢键形成的物质

如脲和盐酸胍等会减弱亲和作用

四 螯合剂

这些化合物会削弱配位键

使亲和作用减弱或者消失

亲和层析具有以下几种优势

亲和层析能够完成

一般方法很难完成的分离

经常可以一步达到大于90%的纯度

亲和层析具有高选择性 高分辨率

高结合载量的特点

且能够快速将目标蛋白与大量的杂质分离

亲和层析的操作流程

一般包含五个步骤

分别是平衡层析柱

上样

洗杂

样品洗脱

以及层析柱再生

我们首先选择合适的缓冲液

平衡层析柱

以保证目标分子与配基的结合效率

在最佳范围内

上样时

样品液中目标分子多数

结合在配基上

此时

由于细胞裂解液中的杂质不能

与配基有效结合

我们常观测到一个很宽的杂质吸收峰

上样完毕后

层析柱上通常还残留

非特异性吸附的杂质分子

因此我们需要先

将这些杂质洗脱

杂质去除后

我们可以利用

洗脱液将目标分子

从配基上洗脱下来

此时我们通常

会观察到一个很高很尖的

目标分子洗脱峰

一般获得目标分子后

我们还将亲和层析柱再生

以达到循环使用的目的

样品的上样前处理

是亲和层析的重要步骤

上样前

我们首先过滤或离心样品

以去除颗粒性固体成分

以免堵塞配体

紧接着

我们调节样品的pH

盐浓度和添加剂等

来提高结合的效率

当样品的缓冲液

不适合亲和层析时

我们可以利用脱盐柱

置换缓冲液

去除能影响结合的物质

亲和层析的洗脱类型

分为非竞争性洗脱

和竞争性洗脱两类

使用非竞争性洗脱时

我们可以通过改变缓冲液的组成

离子强度

或pH等达到洗脱的目的

利用竞争性洗脱方式时

我们可以采用目标分子类似物

或配基类似物

来实现目标分子的纯化

下面

我们通过具体案例

理解上述两种洗脱类型

首先

我们看看非竞争性洗脱的案例

在左栏的例子中

我们可以看到

利用低盐将DNA结合蛋白

结合到Heparin层析柱上

然后

我们可以利用高盐溶液

削弱DNA结合蛋白

与Heparin的结合力

从而将目标蛋白洗脱下来

在右栏的例子中

我们首先让抗体

在中性pH下

与Protein G通过亲和作用

结合到层析柱上

洗脱时

我们将pH降低到2.7左右

削弱抗体与Protein G之间的相互作用

从而将目标抗体洗脱下来

接着

我们看看竞争性洗脱的实例

在左栏的例子中

我们首先利用

His标签蛋白的咪唑基团

与Ni离子的配位作用

将目标蛋白结合到Ni柱上

然后

我们在洗脱液中加入高浓度的咪唑

这些咪唑

可以与His标签蛋白竞争Ni离子

从而将His标签蛋白洗脱

在右栏的例子中

我们首先利用酶与底物反应

将谷胱甘肽还原酶

GST标签蛋白

结合到

固相基质的谷胱甘肽上

然后

我们在洗脱液中

加入还原型谷胱甘肽

这些还原型谷胱甘肽

可以与谷胱甘肽还原酶结合

从而促进GST标签蛋白从亲和柱上脱落

亲和层析

根据洗脱方式分为一步洗脱

分步洗脱和梯度洗脱等

一步洗脱属于非选择性洗脱

通常应用于

高度特异性吸附剂的结合

一步洗脱时

被吸附目标蛋白

可以全部同时被洗脱下来

从而得到较纯的分离物

实践中

Flag标签蛋白的纯化

属于一步洗脱

分步洗脱是选择性洗脱

常应用于基团特异性吸附剂

由于亲和吸附剂上

吸附有特异性不尽相同的

多组分样品

需要用几种不同的洗脱条件

分几步洗脱

这样

我们就可以

将亲和力不同的组分分开

梯度洗脱是分步洗脱的特殊形式

该方法是利用洗脱液浓度的梯度变化

对吸附性质相同

特异性程度不同的组分有效地洗脱

如His标签蛋白既可以采用分步洗脱

也可以采用梯度洗脱

当前随着蛋白质工程的发展

亲和层析得到了越来越广泛的应用

接下来

我将主要讲述亲和层析

在标签蛋白和抗体纯化中的应用

我们首先来讲解抗体纯化

我们先简单了解下抗体的结构

常规的抗体通常由四条多肽链组成

包含两条大致相同的重链和轻链

重链的分子量约为

55KD或70KD

轻链的分子量约为24KD

位于重链

靠近N端1/5

或1/4

和轻链靠近N端的1/2区域

我们称为可变区

可变区的氨基酸的组成和排列

决定了抗体和抗原的结合特异性

位于重链靠近C端3/4或4/5

和轻链靠近C端

1/2区域

我们称之为恒定区

这个区域氨基酸组成和排列

在同一种属动物中的抗体中同型

抗体通常采用

Protein A 和

Protein G纯化

Protein A是一种金黄色葡萄球菌

细胞壁蛋白质

能特异性地

与人和哺乳动物抗体

主要是IgG的Fc片段结合

蛋白质A一般具有5个串联结构域

每个域均可以

和IgG的Fc段结合

蛋白G是一种源自链球菌

G族的细胞表面蛋白

为三型Fc受体

其通过类似于蛋白A的非免疫机制

与抗体Fc段结合

此外

蛋白G还可以和某些

抗体的Fab段结合

实践中

我们如何选择用蛋白A

还是蛋白G来纯化抗体呢

这里

我们给出了蛋白A和蛋白G

分别对不同种属不同抗体类型的

亲和力列表

在纯化时

大家可以根据该表选择纯化方案

例如

Protein G对于

大多数哺乳动物的IgG

比Protein A

有着更高的亲和力

比如人的IgG3

小鼠的IgG1

和鼠IgG2a

但是

我们也注意到

Protein G不与狗的IgG结合

不与人的IgM或IgA结合

下面

我将分别列举

利用Protein A和Protein G

纯化IgG的实例

第一个例子是利用

Protein A填料

首先

右边表格显示的是

Protein A对人源抗体和鼠源抗体

不同IgG亚型的亲和力

结合pH和洗脱pH比较

大家可以参考该表

设计不同的IgG亚型纯化

所需的溶液条件

中间的SDS-PAGE

展示了利用酸性pH洗脱

某IgG蛋白的纯度

洗脱后

的抗体在150KD左右

还原剂可以将轻链和重链解聚

第二个例子显示的是

Protein G纯化细胞培养基上清中的抗体

样品穿透峰显示了

大约55KD的BSA条带

洗脱得到的目的抗体条带

在大约150KD左右

最后归纳抗体亲和层析的注意事项

一

根据抗体种类

合理选择Protein A和Protein G

二

低pH值洗脱后

需要快速中和洗脱的抗体和柱子

如果长时间保存抗体

可以加入

0.02-0.05％叠氮钠

防止长菌

三

保存时加入10%的甘油

可有效防止疏水作用引起的聚集

前面我们讲解了

亲和层析在抗体纯化中的应用

在这里

我们继续讲解亲和层析

在标签蛋白纯化中的应用

标签蛋白纯化的基本原理如下

我们将亲和作用的配基

固定到层析填料的基架上

目标蛋白则与亲和标签融合

标签蛋白通过与配基结合

被吸附到层析填料

从而达到与杂质分离的目的

吸附到填料的重组蛋白

最终通过洗脱被回收

这里展示常用的亲和标签

主要有His标签

Strep标签

Flag标签

GST标签和MBP标签等

在这张表格中列出了这些标签的大小

载量和价格等参数

在此

我不一一详述

大家可以根据实验目的

选择合适的标签

接下来我将详细介绍

通常使用的His标签蛋白

和GST标签蛋白的纯化原理和应用实例

首先我们先介绍His标签

His标签的亲和原理如下

His标签的组氨酸侧链的咪唑基团

带有的孤对电子

可以与过渡金属离子配对

这种配位相互作用

保证了标签蛋白在中性pH值下

比其他杂蛋白

能更有效地吸附在层析柱上

从而达到分离效果

洗脱时

通过高浓度的咪唑竞争结合金属离子

达到回收标签蛋白的目的

His标签有很多优点

首先

标签长度比较短

一般不影响蛋白性质

因此

研究目标蛋白的结构和功能时

无需切除

其次

His标签与金属离子的配位作用比较稳定

可以耐受多种化学试剂

即使在变性条件下

His标签也能够与金属离子

紧密的结合

洗脱时

可以在接近生理条件下的

溶液中加入咪唑洗脱

因而反应条件比较温和

第三

蛋白洗脱后的层析柱再生比较容易

可以反复的使用

大大节约了研究的成本

此外

化学工业的发展导致填料价格低

使得标签蛋白的产量

可以迅速放大

His标签蛋白的洗脱

分为分步洗脱和线性梯度洗脱两种

分步洗脱顾名思义就是

使用特定增加浓度的咪唑

分几步洗脱

达到分离目标蛋白的目的

分步洗脱通常是在了解了

标签蛋白的洗脱条件后采用的方法

线性梯度洗脱通常适用于

his标签蛋白的洗脱条件的

首次摸索

此外

线性梯度洗脱由于采用

线性增加的咪唑浓度梯度

可以将带有连续His的杂蛋白

与目标蛋白分离

能够与His标签结合的金属离子

通常有Cu Ni Zn Co等

这里列举了这些金属离子

与His标签的亲和力

和特异性的差异

从中

我们可以发现

金属离子与His标签的

结合力与特异性成反比

其中

Cu的结合力最强

特异性最低

而Co与之相反

由于CO的特异性高

利用Co柱纯化His标签蛋白

也是常有的方法

在真核蛋白的纯化中

Co柱通常能更有效地

分离目标蛋白

这是由于很多的真核蛋白

带有连续的2-3个

组氨酸残基

值得注意的是

由于Co和

组氨酸结合的亲和力较低

所以在洗杂和洗脱的时候

用的咪唑浓度也较低

如这里的GFP-His纯化所示

洗杂液和洗脱液中

分别含有5mM和150mM的咪唑

远低于使用Ni柱时的浓度

由于His标签蛋白

是利用组氨酸的咪唑基团

与金属离子

的配位作用来纯化

因此

存在相关的注意事项

现列举如下

一 避免缓冲液中有高浓度的电子供体基团

比如氨基 甘氨酸 精氨酸等等

二 缓冲液中不能有强的螯合剂

如EDTA EGTA等等

三 缓冲液中不能有高浓度的强还原剂

比如DTT等

以防止二价Ni金属离子等被还原

四 不能含离子型的去垢剂

比如SDS

以防止Ni等金属离子的流失

五 在破碎细胞时

建议加入蛋白酶抑制剂

比如0.1-1mM的PMSF

防止目标蛋白

被降解而丢失His标签

六 缓冲液里可以加入甘油

以防止蛋白之间

由于疏水相互作用

而发生聚集沉淀 掩盖标签的现象

七 可加入非离子型去垢剂

如Triton Tween NP40等

最高可溶到2%

从而减少背景蛋白的污染

以及去除核酸的污染

除了His标签外

GST标签也被经常使用

原理上

我们是利用谷胱甘肽还原酶GST

能够特异性识别固相基质上

谷胱甘肽

从而达到纯化GST标签蛋白的目的

洗脱GST标签蛋白的方法

通常有两种

如图所示

我们可以用固定浓度的还原型谷胱甘肽

与填料上的谷胱甘肽竞争

从而一步洗脱GST标签蛋白

第二种洗脱GST标签蛋白的方法

是酶切法

我们可以在构建融合蛋白时

在GST标签和目标蛋白之间

插入特异的水解酶序列

如Thrombin酶 TEV酶等

我们将融合蛋白

结合到固相基质上的

谷胱甘肽后

可以添加相应的水解酶

将目标蛋白释放并回收

溶液中的水解酶

也有多种去除方式

例如已有商业化的苯甲醚柱子

专门用来去除凝血酶类

商业化的prescission酶

本身自带GST的标签

可以用GST柱子除去

GST标签蛋白纯化时

还有一些小的注意事项

比如在细胞裂解时

加入

终浓度1–10 mM的 DTT

可以显著提高

GST融合蛋白的结合效率

这是因为DTT能够维持

柱子上配体的还原性

有利于GST蛋白的结合

另外前面提到

GST亲和标签的亲和力

是属于典型的酶与底物的结合

因此降低上样流速

使酶与底物充分反应

或者提高样品的浓度

都有利于提高标签蛋白的回收效率

GST与底物结合的

最佳的PH范围是6.5-8

实验时

要确保体系的pH值

在亲和力最佳区间

到此

我们分别以His标签蛋白

和GST标签蛋白纯化为例

讲述了标签蛋白的

纯化原理和注意事项

在实际运用中

我们可以将多种亲和标签

和纯化方法相组合

提高蛋白的纯化效率

例如

采用N和C端各连一个标签的策略

我们可以将完整的目标蛋白

和该蛋白的片段分开

此外

我们可以利用

去除标签后的目标蛋白

与杂蛋白在固相基质的吸附能力的差异

来提高目标蛋白的纯度

比如

我们可以将纯化后的

His标签蛋白除去His标签后

再过一次Ni柱

此时

吸附能力强的杂蛋白

将会被滞留在柱子上

而目标蛋白在流穿中

以上

我们主要从亲和层析的原理

实验操作

以及实际应用案例

讲解了亲和层析技术

谢谢大家